АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Общие правила работы с микроскопом

Микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Они касаются обращения с прибором и ухода за ним, а также применения правильного освещения, выбора в каждом конкретном случае наилучшего варианта оптической системы (окуляр-объектив-конденсор) и т.п.

При хранении и работе со световым микроскопом необходимо выполнять следующие правила:

1. Перед началом работы следует проверить чистоту линз и, в случае необходимости, протереть их (только снаружи) мягкой тканью или волосяной кисточкой.

2.После работы с иммерсионной системой фронтальную линзу объектива тщательно очищают от масла мягкой тканью, смоченной водой или спиртом. Не рекомендуется применять вату или марлю, оставляющие волокна и нити.

3.Вблизи микроскопа не допускается держать открытыми сосуды с кислотами и нагревать бани.

4.Механически трущиеся части микроскопа не менее 2-3 раз в год следует протирать ксилолом или бензином и смазывать маслом.

5.После работы микроскоп закрывают чехлом или помещают в ящик.

6. Для перенесения микроскопа его берут за тубусодержатель и поддерживают снизу за основание в вертикальном положении.

Рабочий стол предпочтительно должен быть с темной поверхностью, что меньше утомляет глаза, и располагаться подальше от прямого солнечного света.

Установление освещения. Просмотр препаратов микробных культур возможен только при правильно установленном освещении (равномерно освещенное светлое поле зрения).

Неправильное или недостаточное освещение не позволит использо­вать полностью все возможности микроскопа.

В отличие от старых микроскопов, которые были рассчитаны на освещение дневным естественным светом, в современных микроскопах для освещения применяют лишь свет от электрического осве­тителя. Осветители в качестве источника света, как правило, имеют низковольтную лампочку (8 В, 20 Вт). При работе с конденсором Аббе независимо от источника света нужно пользоваться только плоским зеркалом.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30— 40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изо­бражение полностью заполняло отверстие конденсора (объектив 8х, конденсор поднят до упора). Закрыв ди­афрагму осветителя (оставляют лишь небольшое отверстие размером не более 1,0 – 1,2 мм в диаметре), открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, пред­варительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя откры­вают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскры­вать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещен­ности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют. Диафрагмой конденсора пользуются только при смене объективов.

Установку света по Келеру целесообразно применять и при темно-польной и фазово-контрастной микроскопии.

Микроскопия в темном поле. Метод основан на эффекте Тиндаля. При освещении объекта исследования косыми лучами света, эти лучи остаются невидимыми для глаза, так как не попадают в объектив, и поле зрения выглядит не светлым, а темным. Находящиеся в поле зрения неоднородные клетки микроорганизма попадают в сферу прохождения лучей, отклоняют их настолько, что лучи попадают в объектив. Поскольку лучи идут именно от объекта исследования, на фоне темного поля он выглядит интенсивно светящимся.

Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора (параболоид или кардиоид) или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью.

Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центри­руют, как для светлого поля, и, заменив конденсор на специаль­ный, прибавляют свет до максимума, раскрыв до отказа диафрагму и включив реостат осветителя.

Препараты для исследования в темном поле должны быть при­готовлены на очень чистых предметных и покровных стеклах опре­деленной толщины: предметные — не более 1,2 мм, покровные -0,17 мм. Готовят препарат по типу раздавленной капли. Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло — каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора. После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью специальных регулировочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем с помощью нуж­ного увеличения переходят к наблюдению.

Метод используется при исследовании живых клеток микроорганизмов (особенно для изучения крупных объектов, например, дрожжей).

Микроскопия с фазово-контрастным устройством.

Метод предназначен для исследования прозрачных объектов, детали строения которых оптически мало различаются между собой. Основная масса живых клеток прозрачна. Световые лучи не меняют своей амплитуды проходя через них, но изменяются по фазе. Иначе говоря, распространение световых волн в прозрачных однородных объ­ектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения через объект по сравнению со скоро­стью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель свето­преломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называемые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза колебаний прошедшего све­та, характерны для большинства биологических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитуд­ные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объекты при обычном микро­скопическом исследовании остаются невидимыми.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет превратить «фазовый» препарат в «амплитудный».

Для работы по этому методу в дополнение к световому микроскопу необходимо иметь специальное устройство, состоящее из фазовых объективов с пометкой Ф, конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптическое устройство, помещаемое в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Установку устройства производят следующим образом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом ре­вольверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светлопольному конденсору. Затем, поместив на предмет­ный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании методом фазового контраста основ­ным условием является оптимальная освещенность, которая дости­гается установкой света по Келлеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе 40х в окошечке также уста­навливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (кольцевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центрировочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произ­водить исследование препарата.

Люминесцентная микроскопия.

Используется микроскоп люминесцентный МЛ-2, оптическая схема которого отличается от оптической схемы обычного микроскопа источником света (это может быть ртутная или низковольтная лампы) и наличием двух светофильтров (синего перед конденсором и желтого в окуляре микроскопа).

Люминесценцией (или флюоресценцией) называют такое явле­ние, когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Кроме того, вещества, имеющие определенный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретают совершенно иной цвет. Объект, не видимый в ультрафиолетовом све­те, может приобрести яркий блеск после обработки его флюоресци­рующим веществом (флюорохромом). В таком препарате люминесцирующие объекты светятся различным цветом в темном поле зрения. Сила их света бывает различной, но чаще всего она невели­ка, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в за­темненном помещении.

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливается сине-фиолетовый светофильтр (УФС-3, ФС-1 и т. п.). Желтый свето­фильтр (ЖС-3 или ЖС-18) надевают на окуляр микроскопа. С по­мощью этих светофильтров на препарат падает сине-фиолетовый свет, возбуждающий люминесценцию. Однако этот свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата и поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается желтым светофильтром.

Установку освещения производят по методу Келлера, за одним исключением: диафрагма конденсора должна быть полностью от­крыта. Очень важно применение нефлюоресцирующего иммерсион­ного масла. С целью гашения собственной флюоресценции к кедро­вому или другому иммерсионному маслу добавляют на 1 г от 2 до 10 капель нитробензола.

Используя метод люминесцентной микроскопии можно получить: 1) цветное изображение; 2) высокую степень контрастности само­светящихся объектов на черном фоне; 3) исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые объекты; 4) исследовать различные жизненные процессы в динамике их развития; 5) обнаруживать и устанавливать локализацию отдельных микробов и вирусов; 6) развивать тончайшие методы цито- и гисто­химии и экспрессной цитодиагностика, что выгодно отличает этот метод от других.

Электронная микроскопия.

Слишком большая длина волны видимого света (600 нм) не позволяет рассматривать в оптическом микроскопе объекты, диаметр которых меньше этой величины.

Разрешающая способность электронных микроскопов составляет 0,2 – 0,4 нм, рабочее увеличение в среднем – 100000 раз. По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому, но освещается объект не лучом света, а потоком электронов от вольфрамовой нити, которая разогревается до 2500 °С.

Электронный поток вызывает све­чение флюоресцирующего экрана. Если же на пути электронов поместить какой-либо объект, то в зависимости от его плотности электроны будут больше или меньше задерживаться, а соответствую­щие места на экране или фотопластинке окажутся более или менее затемненными. Этот простой принцип в современном электронном микроскопе дополнен принципом отклонения электронных лучей в магнитном поле подобно тому, как световые лучи отклоняются стеклянными линзами.

Источником электронного потока служит катодная лампа с вольфрамовой нитью, которая разогревается до 2500°С. Освобож­дающиеся при этом электроны летят в вакууме с большей или меньшей быстротой по направлению к аноду. В этом движении быстроту определяет напряжение, существующее между анодом и катодом. Чем больше напряжение, тем выше разрешающая способ­ность электронного микроскопа. Анод имеет в центре отверстие, через которое электроны летят в направлении к конденсору. Возле катода расположен отрицательно заряженный цилиндр, как бы сужающий пучок электронов, которые, будучи отрицательно заряже­ны, отталкиваются от стенок цилиндра в середину.

Все это устройство в микроскопах большинства систем распо­ложено наверху, и пучок электронов направляется вниз. Объект исследования находится на их пути и отклоняет электронный луч тем сильнее, чем толще и плотнее его структура. При напряжении около 200 000 В, изучая тонкий препарат, можно обнаружить самые нежные структуры, получить увеличение до 200 000 раз и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Путь электронного пучка от объекта до фотографической плас­тинки лежит мимо электрических или магнитных полей, которые, подобно линзам в световом микроскопе, концентрируют и направля­ют электронные лучи. Наконец, после ряда увеличений, которое претерпевает изображение объекта, оно воспринимается на фото­графической пластинке. Все виды фотопластинок чувствительны к электронному лучу. По пути прохождения электронного пучка он дважды может быть перехвачен и отброшен на поверхность экрана-пластинки, покрытой сульфидом цинка, где изображение объекта можно увидеть невооруженным глазом.

В некоторых системах электронных микроскопов имеются до­полнительные приспособления для стереоскопической микроскопии, для наблюдения в темном поле зрения. Различные системы дают разное увеличение — от 1000 до 500000 раз. Установки эти пока еще сложны и требуют квалифицированного обслуживания.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1154 | Нарушение авторских прав