АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методическая разработка. для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов

для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов

к лабораторной работе

«Микроскопия»

1. Научно-методическое обоснование темы:

Возможность разрешения деталей предмета зависит от размеров его изображения на сетчатке глаза или угла зрения. Однако, иногда невозможно увеличить угол зрения из-за некоторых технических ограничений. В связи с этим используются оптические приборы, в том числе микроскоп.

Микроскоп является одним из важнейших приборов в медицинских и биологических исследованиях. При этом микроскоп позволяет не только визуально изучать недоступные глазу объекты, но проводить некоторые измерения. С помощью микроскопа определяют линейные размеры микрообъектов, измеряют показатель преломления стеклянной пластины и определяют числовую апертуру объектива.

2. Краткая теория:

Микроскоп - оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов, не видимых невооруженным глазом. Различные типы микроскопов предназначаются для рассматривания, изучения и измерения микроструктуры органических клеток, бактерий, срезов тканей, микрокристаллов, минералов, микросхем и других объектов, размеры которых меньше минимального разрешения глаза, равного 0,1мм. Микроскоп дает возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,2 мкм. Обычно микроскоп имеет двухступенчатую систему увеличения, образованную двумя линзами (объективом и окуляром) и обеспечивающую увеличение до 1500 крат. В оптическую схему микроскопа входят также элементы, необходимые для освещения объекта.

Линзой называется прозрачное тело, ограниченное двумя криволинейными (обычно сферическими) поверхностями или одной криволинейной и одной плоской поверхностью.

На рис. 1 изображены поперечные сечения двояковыпуклой (а) и двоя­ковогнутой (б) сферических линз (R₁, R₂ и R₃ — ради­усы сфер). Прямая SS´, проходящая через центры кривизны поверхностей, образующих линзу, назы­вается главной оптической осью (или просто осью) линзы.

Рис.1

Если толщина линзы О₁О₂ пренебрежимо мала по сравнению с радиусами кривизны линзы, то она называется тонкой.

Рис.2

У тонкой линзы (рис.2) имеется точка О, обладающая тем свойством, что проходящие через нее лучи практически не преломляются линзой. Эту точку называют оптическим центром линзы: она лежит на пересече­нии главной оптической оси со средним сечением NN' линзы. Любая прямая РР´, проходящая под углом к главной оптической оси через оптический центр линзы, называется побочной оптической осью. Луч, идущий вдоль оптической оси (главной или побочной), носит назва­ние центрального луча.

Линзу можно представить как совокупность множества призм (рис. 3).

Рис.3

Тогда становится очевидным, что выпуклая линза отклоняет лучи к оптической оси, а вогнутая—от оптической оси. Поэтому выпуклая линза называется собирающей, а во­гнутая — рассеивающей.

Лучи параксиального (приосевого) светового пучка, распространяющиеся параллельно главной оптической оси, пересекаются в точке, лежащей на этой оси и называемой фокусом линзы (главным фокусом). У всякой линзы имеются два фокуса по обе стороны от нее (рис.4).

Рис.4

Плоскость MN, проведенная через фокус линзы перпендикулярно к главной оптической оси, называется фокальной плоскостью (рис.5). Лучи, падающие на линзу параллельно какой-либо побочной оптической оси, после преломления в линзе пересекаются в точке, лежащей на фокальной плоскости. У линзы имеются две фокальные плоскости, расположенные по обе стороны от нее. Точки пересечения побочных оптических осей с фокальными плоскостями линзы называют побочными фокусами линзы (точка F´ на рис.5).

Рис.5

Расстояние OF=f от оптического центра линзы до ее фокусов называется фокусным расстоянием линзы.

Изображение любой точки предмета в линзе находится в точке пересечения двух лучей (или их продолжений), вышедших из этой точки и прошедших через линзу. Обычно для построения изображения используют два из трех лучей:

1) Луч, проходящий без преломления через оптический центр линзы;

2) Луч, падающий параллельно главной оптической оси. После преломления в линзе этот луч (или его продолжение) проходит через задний (относительно предмета) главный фокус;

3) Луч (или его продолжение), который проходит через передний главный фокус и после преломления в линзе идет параллельно главной оптической оси.

Величина D = 1/f называется оптической силой линзы. Она измеряется в диоптриях (дп). Диоптрия равна оптической силе линзы с фокусным расстоянием 1 м.

Оптическая сила собирающих линз (как и фокусное расстояние) считается положительной, а рассеивающих – отрицательной.

Построим ход лучей в простейшем микроскопе (рис.6). Предмет АБ находится немного впереди от переднего фокуса объектива. Изображение А'Б' строится по обычным правилам построения изображения в собирающей линзе. Оно является промежуточным изображением, увеличенным, перевернутым, действительным и лежит за двойным фокусным расстоянием объектива.

Рис.6

Окуляр располагается так, чтобы изображение А'Б' находились несколько ближе к линзе, чем ее передний фокус. Лучи, образующие точку Б' промежуточного изображения, надо продолжить до пересечения с главной плоскостью окуляра в точках l и l'. Через оптический центр окуляра О' проводятся побочные оси, параллельные этим лучам до пересечения в точках m и n с фокальной плоскостью MN окуляра, которая совпадает с главной плоскостью глаза. Аналогично через оптический центр глаза О'' проводятся побочные оси, параллельные отрезкам lm и l ' m ' до пересечения с фокальным плоскостью глаза Ф_гл. Проведя лучи через эти точки и точки m и n, получим за фокальной плоскостью глаза точку Б''' изображения на сетчатке глаза. Точка Б'' мнимого изображения найдется как точка пересечения продолжения отрезков lm и l ' n.

Таким образом, микроскоп дает увеличенное, перевернутое и мнимое изображение. Угловое увеличение γ оптического прибора определяется отношением угла зрения на предмет через оптический прибор к углу зрения на этот предмет невооруженного глаза:

, (1)

Для микроскопа угловое увеличение численно равно произведению линейного увеличения объектива β_об и углового увеличения окуляра:

γ_м = β_об ∙ γ_ок, (2)

где- - линейное увеличение объектива, Δ – расстояние от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра, т.е оптическая длина тубуса; - угловое увеличение окуляра, L- расстояние наилучшего зрения, f_об и f_ок - фокусные расстояния объектива и окуляра.

Свойство оптического прибора давать раздельное изображение двух близко расположенных светящихся точек называется разрешающей способностью прибора, и характеризуется пределом разрешения, т.е. наименьшим расстоянием между этими точками. Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность оптического прибора. Предел разрешения определяется формулой:

, (3)

где - λ длина волны света в воздухе, n - показатель преломления среды между предметом и объективом (для воздуха n =1), θ - апертурный угол.

Необходимым элементом оптических систем, образующих изображение предметов, является оптическая диафрагма, которая представляет собой экран с отверстием. Оптическая диафрагма дает возможность регулировать световой поток (ширину пучка световых лучей) попадающий в оптическую систему. Отверстие диафрагмы располагается так, что ее центр совпадает с главной осью оптической системы, а плоскость отверстия перпендикулярна оси.

Апертурной диафрагмой называется диафрагма, ограничивающая световой поток независимо от места ее расположения в оптической системе (диафрагма может располагаться и перед входной линзой прибора, в нашем случае входной линзой является объектив).

Апертурная диафрагма Д (рис.7, а) ограничивает ширину световых пучков, поступающих в систему от отдельных точек предмета, находящихся вне поля зрения NN и поэтому падающих на линзу под большим углом. Диафрагма способствует устранению аберраций и повышает резкость изображения, хотя при этом ограничивается количество световых лучей,

Рис.7

Для определения границ поля зрения надо провести пунктирные линии АN. Угол θ, равный половине угла, под которым отверстие апертурной диафрагмы видно из точки О (точки пересечения главной оси системы с плоскостью предмета NN), называется апертурным углом оптической системы. Апертурный угол – это пространственный угол, ограничивающий конус световых лучей, попадающих в линзу. Апертурным углом называют также плоский угол при вершине этого конуса. В микроскопе предмет помещается почти у самого переднего фокуса объектива, а апертурный угол ограничивается оправой АА самой линзы (см. рис. 7 б)

Величина А= n∙sin θ называется числовой (численной) апертурой.

Увеличение микроскопа в пределах 500-1000А (А-числовая апертура) называется полезным, т.к. при нем глаз различает все элементы структуры объекта, разрешаемые микроскопом. Полезное увеличение γ_м микроскопа должно быть не меньше величины, определяемой соотношением пределов разрешения глаза Z_гл и микроскопа Z_М:

, (4)

Разрешающая способность микроскопа прямо пропорциональна апертуре объектива и для ее повышения пространство между объективом и предметом заполняется жидкостью с большими (n >1) показателем преломления. Максимальный апертурный угол может быть порядка 70⁰, тогда для сухого объектива А = sin θ ≈ 0,94.

Усовершенствованием микроскопа явилось применение иммерсионного объектива. В этом случае пространство между наблюдаемым предметом и входной линзой заполняется жидкостью (иммерсией) с показателем преломления, близким к стеклу. В иммерсионных системах по сравнению с сухими системами получают больший апертурный угол. В качестве иммерсии используют воду (n=1,33), кедровое масло (n=1,55) и др. Апертура объективов с масляной иммерсией может быть доведена до 1,4. При этом возможно разрешение структур с расстоянием между элементами 0,2 мкм. Дальнейшее повышение разрешающей способности микроскопа достигается уменьшением длины волны света, например путем применения ультрафиолетового излучения.

Наиболее распространенным примером оптической микроскопии является метод темного поля, который осуществляется путем применения особого конденсора. Конденсор темного поля состоит из нескольких линз особой формы, образующих наклонные пучки света. Падая на мелкие элементы объекта, свет рассеивается на них. Это делает объект видимым на общем темном поле зрения микроскопа.

Фазово - контрастный метод применяется для наблюдения малоконтрастных объектов. Он основан на использовании разности фаз, которая образуется при прохождении света через различные структуры исследуемого объекта. Для фазово- контрастной микроскопии применяют особые объективы, содержащие фазовую пластинку (при этом лучи получают дополнительную разность хода) и специальные конденсоры.

При прохождении света через ровную и плоскую границу двух прозрачных веществ неодинаковой оптической плотности падающий луч света АО разделяется на два луча – отраженный луч ОВ и преломленный луч ОД (рис. 8).

Рис.8

Направления этих лучей определяются следующими законами отражения и преломления света:

1. Луч АО, падающий на преломляющую поверхность, нормаль к поверхности в точке падения POP, луч отражен­ный ОВ и луч преломленный OD лежат в одной плоскости.

2. Угол отражения РОВ численно равен углу паде­ния РОА.

3. Синус угла падения i относится к синусу угла пре­ломления r, как скорость света в первой среде υ₁ относится к скорости света во второй среде υ₂:

, (5)

Последний закон говорит о том, что свет распростра­няется в различных средах с различной скоростью.

Для двух данных сред и для луча данной длины волны отношение скорости света в среде 1 к скорости света в среде 2 или отношение синуса угла паде­ния к синусу угла преломления есть величина постоянная, т. е.

= const=n₂₁ ; n₂₁ = .

Величина n_{2 1} называется от­носительным показателем {коэф­фициентом) преломления второй среды по отношению к первой.

Если одна из сред, напри­мер 1 — вакуум или воздух, то показатель преломления n данной среды 2 по отношению к вакууму называется абсолютным показателем преломле­ния данной среды или просто показателем (коэффициентом) преломления.

Абсолютный показатель преломления среды 2 (рис.8):

; ,

где с – скорость света в вакууме, υ₂ - скорость света в данной среде 2, т.е. показатель преломления среды есть отношение скорости света в вакууме к скорости света в данной среде:

, (6)

Показатель преломления зависит от длины волны света и от свойств среды. Абсолютные показатели преломления больше единицы. Это означает, что скорость распростране­ния света в данной среде всегда меньше, чем в вакууме.

Относительный показатель преломления двух сред п₂₁ связан с абсолютными показателями преломления сред п₁ и п₂ следующим соотношением:

, (7)

Для определения показателей преломления веществ существуют различные методы. Одним из них является метод определения показателя преломления стекла при помощи микроскопа.

В основе метода ле­жит явление кажущегося уменьшения толщины стеклянной пластинки вследствие преломления световых лучей, прохо­дящих в стекле при рас­сматривании пластинки нормально к ее поверх­ности. Схема прохожде­ния лучей через стеклян­ную пластинку дана на рис. 9.

Рис.9

В точку А, находящуюся на нижней поверхности стек­лянной пластинки, падают два луча света 1 и 2. Луч 2 падает на пластинку нормально к ее поверхности и поэтому проходит сквозь пластинку и выходит в воздух в точке С, не испытывая преломления. Луч 1 преломляется и выходит из пластинки в точку О по направлению к точке D.

При выходе из пластинки луч OD образует угол прелом­ления r — больший, чем угол падения i. Если смотреть из точки D по направлению DO, то наблюдатель будет видеть точку пересечения лучей OD и АС не в точке A, а в точке Е, т. е. толщина пластинки будет казаться равной СЕ.

Из рис.9 видно, что кажущаяся толщина пластинки СЕ = h меньше истинной, т. е. действительной ее тол­щины СА = H.

Используя рис.9 выведем формулу, по которой вычисляется показатель преломления исследуемого вещества. Из треугольников СОЕ и СОА имеем:

СО = СЕ · tg r, (8)

и

СО = АС · tg i, (9)

Приравнивая (8) и (9), получаем:

СЕ · tg r = АС · tg i, (10)

где CE = h, а АC = H. Тогда

tg r / tg i = n =H / h, (11)

Так как при малых углах (а в объектив попадают лучи под малыми углами) тангенс угла примерно равен его синусу, то

n = H / h, (12)

Истинная толщина пластинки H измеряется микрометром или штангенциркулем, а кажущаяся h – микроскопом.

В медицинских и биологических исследованиях микроскопы часто используют для измерения размеров малых объектов. Для этой цели микроскоп снабжают специальным устройством — окулярно-винтовым микрометром (рис.10), который представляет собой насадку, надевающуюся на верхний конец тубуса микроскопа вместо окуляра. Оптическая часть микрометра состоит из линзы-окуляра, неподвижно закрепленной стеклянной шкалы и подвижной стеклянной пластинки, на которую нанесены перекрестье и два вертикальных штриха (биштрих) над ним, параллельные делениям шкалы. Стеклянная пластинка с перекрестьем перемещается вдоль шкалы микрометра с помощью микрометрического винта.

Рис.10.

Окулярно-винтовой микрометр закрепляют на тубусе так, чтобы стеклянная шкала находилась в плоскости, в которой расположено действительное изображение предмета, создаваемое объективом микроскопа. При этом изображение шкалы при рассматривании в окуляр совмещается с изображением предмета. Перемещая с помощью микровинта подвижную пластинку, можно совместить перекрестье сначала с одним краем рассматриваемого предмета, а затем с другим. При этом можно определить, какому числу делений шкалы микрометра соответствует данное изображение.

Перемещение пластинки с перекрестьем на одно деление шкалы микрометра соответствует одному полному обороту микрометрического винта. Барабан микрометрического винта разделен на 100 делений; следовательно, с помощью окулярно-винтового микрометра можно производить измерения предметов с точностью до 0,01 деления шкалы.

Полный отсчет по шкалам окулярного микрометра складывается из отсчета по неподвижной шкале и отсчета по барабану винта. Отсчет по неподвижной шкале в поле зрения определяется положением биштриха, т.е. числом делений шкалы, на которое переместится биштрих, считая от нулевого деления шкалы.

Отсчет по барабану микрометрического винта производится точно так же, как и на обычном микрометре, т.е. определяется деление шкалы барабана, которое находится против индекса, нанесенного на неподвижном цилиндре.

Для определения размеров предмета необходимо знать цену деления окулярно-винтового микрометра. Под ценой деления окулярно-винтового микрометра понимают выраженную в миллиметрах длину отрезка, рассматриваемого в микроскоп, изображение которого занимает одно деление шкалы микрометра.

Для определения цены деления окулярно-винтового микрометра применяют объектный микрометр — шкалу с известной ценой деления. Объектный микрометр рассматривают в микроскоп как предмет и, совмещая в поле зрения объектную и окулярную шкалы, определяют цену деления окулярного микрометра.

В данной лабораторной работе используется объект-микрометр с ценой деления 0,01 мм.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 822 | Нарушение авторских прав