АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

НАФТОЛ-AS D-ХЛОРАЦЕТАТ-ЭСТЕРА-

ЗА. Метод Молони с соавт. П р и н ц и п и обо-

р у д о в а н и е такие же, как для определения

а-нафтилацетат-эстеразы.

Р е а к т и в ы. 1. 10% раствор формалина

в метаноле (сохраняют в холодильнике). 2. Бу-

ферный раствор Михаэлиса (рН 7,4). 3. Наф-

тол-АS-D-хлорацетат. 4. Ацетон х. ч. 5. Грана-

товый прочный GBC или синий прочный ВВ.

6. Ядерный краситель. 7. Инкубационная среда:

10 мг нафтол-АS-D-хлорацетата, растворенного

в 0,5 мл ацетона, 10 мл буферного раствора

(реактив № 2), разведенного пополам дистил-

лированной водой (добавляют по каплям), 10 мг

реактива № 5; быстро встряхивают во избежа-

ние образования осадка, смесь фильтруют.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. Н е

требуется.

Х о д о п р е д е л е н и я. Свежеприготовлен-

ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют

в холодном 10 % растворе формалина в метано-

ле в течение 30 с и затем высушивают. Фиксиро-

ванные препараты можно сохранять несколько

месяцев. Помещают в инкубационную смесь при

комнатной температуре на 30 мин. Промывают

в проточной воде. Докрашивают ядерным кра-

сителем.

Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Фермент

выявляется в виде синих или фиолетовых гранул

в цитоплазме сегментоядерных нейтрофилов,

лимфоциты и моноциты фермента не содержат.

В мазках пунктата костного мозга здоровых

людей наибольшую активность фермента обна-

руживают в промиелоцитах. По мере созревания

гранулоцитов активность нафтол-АS-D-хлор-

ацетат-эстеразы несколько снижается, но оста-

ется довольно высокой. Наиболее высокая интен-

сивность реакции наблюдается при фиксации

в парах формалина при комнатной температуре.

Время фиксации до 10 мин не оказывает влияния

на уровень активности фермента, лишь при

фиксации в течение 30 мин и дольше активность

фермента снижается.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Высокая

активность фермента обнаружена в властных

клетках при промиелоцитарном остром лейкозе,

ничтожная — при остром монобластном; при

других формах острых лейкозов в властных

клетках активность не выявлена.

Л и т е р а т у р а. Руденс Ю. Ф., Буй-

кис И. М. Лаб. дело., 1971, № 10, с. 592;

Moloney W. С. et a l. J. Histochem. Cytochem.,

1960, vol. 8, p. 200—207; Schmalzl F.\ Braunsteiner

H. Klin. Wschr., 1968, Bd 46, H. 12,

S. 642—650.

ДЕГИДРОГЕНАЗЫ — группа окислитель-

но-восстановительных ферментов, локализу-

ющихся в митохондриях цитоплазмы клеток.

Для исследования различных дегидрогеназ ис-

пользуют метод Нахласа с соавт. в модифика-

циях, основанный на реакции восстановления

солей тетразолия и выпадения осадка диформа-

зана в местах активности ферментов.

СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА (СДГ; К

Ф. 1.3.9.9.1). Метод Нахласа с соавт. (моди-

фикация Кваглино, Хейхо). П р и н ц и п. Ак-

тивность фермента оценивается по реакции вос-

становления солей тетразолия в виде осадка

диформазана синего цвета.

Р е а к т и в ы. 1. 60 % водный раствор аце-

тона. 2. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,4).

3. 0,2 М раствор сукцината натрия. 4. 0,6 М

раствор бикарбоната натрия. 5. 0,03 М раствор

хлорида алюминия. 6. 0,03 М раствор хлорида

кальция. 7. Тетразолий нитро ВТ. 8. 0,1 % рас-

твор прочного красного. 9. Инкубационная сре-

да: 10 мл реактива № 3, 2 мл реактива № 4,

0,2 мл реактива № 5, 0,2 мл реактива № 6,

10 мг тетразолия в 10 мл дистиллированной

воды, дистиллированной воды до 40 мл.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.

Термостат.

Х о д о п р е д е л е н и я. Свежеприготовлен-

ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют

в ацетоне при комнатной температуре 30—60 с.

Промывают в дистилированной воде и высуши-

вают на воздухе. Инкубируют в инкубационной

среде в течение 1 ч при 37 °С. Промывают дис-

тиллированной водой. Докрашивают 0,1 % раст-

вором прочного красного 10 мин.

Метод Нахласа с соавт. (модификация

Р. П. Нарциссова). П р и н ц и п тот же.

Р е а к т и в ы. 1. 60 % раствор ацетона, на-

сыщенный трилоном Б. 2, 1/15 M фосфатный

буфер (рН, 7,2). 3. Сукцинат натрия. 4. Пара-

нитротетразолий фиолетовый. 5. Трилон Б. 6.

0,5 % раствор метилового зеленого на ацетатном

буфере (рН 5,0). 7. Инкубационная среда:

540 мг сукцината натрия растворяют в 10 мл

дистиллированной воды, добавляют 10 мл бу-

ферного раствора (реактив № 2) и 10 мл раст-

вора пара-нитротетразолия в дистиллированной

воде (1 мг/мл), 13 мг трилона Б (рН довести до

7,2) и дистиллированной воды до 40 мл. Среда

может быть пригодна 1—2 нед при хранении

в холодильнике.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.

1. Термостат или водяная баня. 2. Холодиль-

ник.

Ход о п р е д е л е н и я. Фиксируют мазки

ацетоном (реактив № 1) при комнатной темпе-

ратуре в течение 30 с. Ополаскивают дистил-

лированной водой 3—5 с и высушивают. Инку-

бируют в инкубационной среде в течение 1 ч

при 37 °С. Промывают проточной водой в тече-

ние 1 мин. Ополаскивают дистиллированной

водой 3—5 с. Докрашивают метиловым зеленым

5—10 мин. Промывают в проточной воде. Допол-

нительно фиксируют мазки парами формалина

в течение 30 мин (для предотвращения раст-

ворения формазана нитротетразолия фиолето-

вого в иммерсионном масле).

а-ГЛИЦЕРОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

(а-ГФДГ). Метод Нахласа с соавт. (модифика-

ция Р. П. Нарциссова). П р и н ц и п см. Сук-

цинатдегидрогеназа.

Р е а к т и в ы. 1. 60 % раствор ацетона, на-

сыщенный трилоном Б. 2. 1/15 M фосфатный

буфер (рН 7,2). 3. а-Глицерофосфат натрия.

4. Пара-нитротетразолий фиолетовый. 5. Трилон

Б. 6. 0,5 % раствор метилового зеленого на

ацетатном буфере (рН 5,0). 7. Инкубационная

среда: 630 мг ex-глицерофосфата натрия раство-

ряют в 10 мл дистиллированной воды, добав-

ляют 10 мл буферного раствора (реактив № 2),

10 мл раствора пара-нитротетразолия в дистил-

лированной воде (1 мг/1 мл), 13 мг трилона Б

(рН доводят до 7,2) и дистиллированной воды до

40 мл. Среда пригодна в течение 1—2 нед при

хранении в холодильнике.

О б о р у д о в а н и е и ход о п р е д е л е -

н и я см. Сукцинатдегидрогеназа (модифика-

ция Р. П. Нарциссова).

Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У здоровых

СДГ и а-ГФДГ выявляются в виде гранул в ней-

трофилах, лимфоцитах, тромбоцитах перифери-

ческой крови и миелобластах, гранулоцитах,

мегакариоцитах, эритро- и нормобластах кост-

ного мозга.

СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,1 Ѓ}0,05;

а-ГФДГ—0,8Ѓ}0,08. У детей активность фер-

мента СДГ обнаружена в 46 % лимфоцитов.

У здоровых взрослых в пунктате костного мозга

около 88 % недифференцированных клеток име-

ют активность фермента (+), все ядерные эле-

менты эритроидного ряда и гранулоциты прояв-

ляют активность на (+) и (+ +).

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Снижение

активности ферментов в лимфоцитах отмечено

в период приступа бронхиальной астмы, при

хроническом лимфолейкозе. Повышение актив-

ности ферментов обнаружено у больных злока-

чественными опухолями в гранулоцитах, сниже-

ние активности — при хроническом миелолей-

козе.

Л и т е р а т у р а. Нарциссов Р. П. Арх.

анат., 1969, № 5, с. 85—91; Nachlas M. M. et a l.

j. Histochem., Cytochem., 1957, vol. 5, p. 420—

436; Quaglino D., Hayhoe F. Nature, 1960, vol.

187, № 4731, p. 85—86.

ГЛИКОГЕН локализуется в цитоплазме кле-

ток и играет важную роль в энергетическом

метаболизме клеток. При цитохимическом иссле-

довании гликогена используют главным образом

PAS- или ШИК-реакцию (по названию реакти-

вов— шифф-йодная кислота).

Метод Шабадаша. П р и н ц и п. Под влия-

нием периодата калия гликоген окисляется с об-

разованием альдегидных соединений, легко реа-

гирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернис-

тая кислота). В местах локализации гликогена

выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание.

Р е а к т и в ы. 1. 0,03 М раствор периодата

калия или натрия: 230 мг периодата растворяют

в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед

употреблением. 2. 1 н. НС1: 82,5 мл концентриро-

ванной НС1 отн. плотности 1,19 доливают дис-

тиллированной водой до 1 л. 3. Основной фуксин

(для фуксин-сернистой кислоты). 4. Метаби-

сульфит калия. 5. Реактив Шиффа; 1 г основного

фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистил-

лированной воды. По мере охлаждения в раст-

вор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл

1 н. НС1. Оставляют на сутки. Для полного

обесцвечивания добавляют растолченную таб-

летку карболена, оставляют на сутки, затем

фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (луч-

ше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен

к употреблению в течение нескольких месяцев

(легкая степень покраснения свидетельствует

о непригодности реактива). 6. Сернистая вода:

к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия

добавляют 200 мл дистиллированной воды и

10 мл 1 н. HCI. Готовят перед употреблением.

7. 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой

краски (лихтгрюн).

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.

1. Горелки. 2. Термостат. 3. Весы.

Х о д о п р е д е л е н и я. Препараты фикси-

руют (тотчас после приготовления) в абсолют-

ном спирте в течение 30 мин. Промывают в двух

сменах дистиллированной воды. Погружают в

раствор периодата на 20 мин (в темноте). Про-

мывают в трех сменах дистиллированной воды.

Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 —

2 мин). Окрашивают реактивом Шиффа в тече-

ние 30—40 мин (в темноте). Промывают в трех

сменах сернистой воды по 3 мин. Промывают

в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.

Окрашивают светло-зеленой краской в течение

10—20 с. Промывают в дистиллированной воде.

Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый

цвет на зеленом фоне препарата. Кроме глико-

гена, положительную реакцию могут давать та-

кие ШИК-положительные вещества, как кислые

и нейтральные мукополисахариды, мукопроте-

ины, гликопротеины и др. Гликоген легко отдиф-

ференцировать от других веществ пробой со

слюной или диастазой.

Проба со слюной. Препарат помещают в све-

жесобранную слюну и оставляют на 30 мин

в термостате. Затем производят окраску на гли-

коген приведенным выше методом. Инкубация

препаратов со слюной способствует расщепле-

нию гликогена, и при реакции с реактивом

Шиффа не получается розовой окраски.

Идентифицировать гликоген можно также

путем предварительной инкубации мазков с диа-

стазой (а-амилаза; К. Ф. 3.2.1.1) (1 мл про-

фильтрованной диастазы растворить в 40 мл

изотонического раствора хлорида натрия) в те-

чение 30 мин в термостате.

Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В мазках

периферической крови гликоген содержится в

цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мел-

кой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в

виде небольшого количества крупных зерен).

В пунктате костного мозга гликоген выявля-

ется в нейтрофилах разной степени зрелости,

лимфоцитах и мегакариоцитах. У здоровых лю-

дей количество интенсивно окрашенных нейтро-

филов крови (+ + +) колеблется в пределах

2—12 %, средней интенсивности окраски

(+ +)—в пределах 72—90%, слабо окра-

шенных (+) —от 4 до 18%. СЦК равен

1,71—2,04.

В лимфоцитах крови здоровых людей глико-

ген содержится в виде небольшого числа гранул

в 10,4 Ѓ}2,3 % клеток. В мегакариоцитах кост-

ного мозга гликоген обнаруживается в виде

гранул (от единичных до 30—50), напоминая

скопления кровяных пластинок. У здоровых лю-

дей число гликогенположительных мегакариоци-

тов составляет 62,0 Ѓ}3,55 %.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе-

ние содержания гликогена в нейтрофилах наб-

людается при различных воспалительных про-

цессах, эритремии, сахарном диабете, уменьше-

ние — при агранулоцитозах, лучевой болезни,

при хроническом миелолейкозе, особенно при

прогрессировании процесса. Повышение числа

гликогенположительных лимфоцитов (до 70—

80 %) характерно для лимфопролиферативных

заболеваний, особенно хронического лимфолей-

коза. При тромбоцитопенической пурпуре и сим-

птоматических тромбоцитопениях число глико-

генположительных форм мегакариоцитов значи-

тельно снижено, после спленэктомии оно повы-

шается до нормальных величин.

При острых лейкозах гликоген можно обна-

ружить в властных клетках: при остром миело-

бластном лейкозе — в виде мелкой зернистости

в цитоплазме или в виде диффузного ее окраши-

вания, при остром лимфобластном лейкозе —

в виде крупных гранул, расположенных в цито-

плазме вокруг ядра, при остром монобластном

варианте бластные клетки содержат гликогена

немного в виде диффузной окраски, при эритро-

миелозе гликоген в виде гранул обнаружива-

ется в эритробластах.

Л и т е р а т у р а. Шабадаш А. Л. Изв.

АН СССР; серия биол., 1947, № 6, с. 745—

760; Шабадаш А. Л. Докл. АН СССР, 1949,

т. 68, № 2, с. 389—392.

КАТИОННЫЙ БЕЛОК. Неферментный ка-

тионный белок локализуется в лизосомах гра-

нулоцитов и играет важную роль в реализации

фагоцитарной функции клеток. При цитохими-

ческом исследовании катионных белков исполь-

зуют методы, основанные на применении диа-

хромных анионных красителей.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 524 | Нарушение авторских прав