АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Ионный состав
Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды длякультивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли собоймодификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержанияжизни клеток – Na+, К+, Са2+, Mg2+, и , растворенные вбикарбонатном буфере (НCO3). Также добавлялись антибиотики дляпредотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина илисыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка используется бычий иличеловеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческаясыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческаятрубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Болеесложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и былиразработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивированияэмбрионов различных видов млекопитающих.Энергетическими субстратами для ооцитов и эмбрионов млекопитающих вкультуральной среде обычно служат пируват, лактат и глюкоза, причемусвоение глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии несколькихклеточных делений, а до этого предпочтительным источником энергии служитпируват.Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется ихприсутствием в жидкости яйцеводов многих видов млекопитающих. Было показано,что добавление глутамина в культуральную среду оказывает положительноевлияние на развитие эмбрионов многих видов млекопитающих. Однако привведении в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаютсястабильны в условиях культивирования – при температуре 37С многие из нихразрушаются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладаеттоксическим эффектом.Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработанасреда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержитаминокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – дажежирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в различныхлабораториях. При том, что роль многих компонентов сложных сред до сих порне была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты. CO2-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO3 в воздухе при температуре 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условиясоблюдаются при использовании CO3-инкубаторов, поддерживающихнеобходимую температуру, влажность и уровень CO2 в камере.Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа избаллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды.Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицинскимстандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая углекислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO3-инкубаторов поддерживается постояннымиспарением воды со дна камеры либо из специального лотка. Также в некоторыхсовременных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух,позволяющая автоматически поддерживать влажность в камере до 90%.В связи с высоким уровнем влажности в инкубаторах высок риск роста бактерийи плесени, поэтому необходима регулярная очистка всех поверхностей камеры.Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать этонадо с большой осторожностью, поскольку известно негативное влияниеэтилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе сфолликулярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulusoophorus (яйценосный бугорок) представляет собой часть фолликулярногоэпителия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессефолликулогенеза. Помимо прочего фолликулярная жидкость содержит фибриноген,что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколько минут послеаспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложнообнаружить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используютсядва основных подхода:1. Фолликулярную жидкость просматривают под микроскопом сразу послеаспирации и найденные ооциты незамедлительно помещают в среду для отмывки.2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду сгепарином, предотвращающую образование кровяных сгустков.Как правило, в большинстве лабораторий руководствуются вторым подходом. Приэтом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 млдобавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрациюгепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин неоказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона.Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательноотмывают в специальной среде.После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает вэмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается наприсутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирокпереливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопомили инвертированным микроскопом при небольшом увеличении. Как правило,комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистыекомки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.Найденные ооциты помещаются в среду для отмывки, содержащую HEPES-буфер,позволяющий манипулировать с ооцитами на воздухе без риска изменения рН вщелочную сторону (такие среды производятся большинством фирм,специализирующихся на производстве сред для ЭКО), затем отмываются вкультуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальнуючашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооцитов икультивирование эмбрионов.Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды,покрытых слоем минерального масла, предварительно эквилиброванного скультуральной средой в присутствии 5% С02. Преимуществамикультивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральнуюсреду микроорганизмов и частичек пыли, возможность культивирования внебольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшойконцентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испарения воды ивыхода CO2 из среды вне инкубатора. Однако, если капли со средойпод маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходномуравновесию влажности и концентрации CO2 займет гораздо большевремени, чем в отсутствие масла.Манипуляции с ооцитами проводят с помощью оттянутых стерильных пастеровскихпипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклянных(пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют идругие способы манипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зависит отопыта и желания эмбриолога.Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценитьколичество, качество и степень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж
| Ооцит
| Характеристика
|
| Очень незрелый
| Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы вокруг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - зародышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформировалось
|
| Незрелый
| Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло
|
| Преовуляторный
| Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано
|
| Перезрелый
| Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно
|
| Лютеинизированный
| Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желеобразную массу с небольшим количеством клеток
|
| Дегенеративный
| Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен
| Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, какправило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита.Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточночасто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако болееточное определение степени зрелости (если клетки corona radiata и cumulusудаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооцитаи увеличению риска полиспермии при оплодотворении.На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходестимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась послеудаления клеток cumulus. Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенеративный ооцит (См. рис. 3)
|
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 563 | Нарушение авторских прав
|
|