АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Работа №2Методы создания анаэробных условий

1) Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в среде без воздуха

•Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества:

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьино-кислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующим веществами является среда тиогликолеваякоторая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выращенной чистой культуры анаэробов.

•Посев микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев уколом

Техника посева. Посев уколом в столбик агара (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий и длительного хранения культур. При посеве уколом в пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают простерилизованной на пламени длинной совершенно прямой платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки. Вынимают иглу, обжигают край пробирки и пробки, закрывают пробирку, прожигают иглу, ставят ее в подставку, надписывают пробирку и помещают в штатив.

• Посев по способу Веньяль-Вейона

Техника посева. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50^оС агаром засевают исследуемый материал. Затем помещают агар с посевом в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правша асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

• Механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы

Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с рези-новой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

• Замена воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

2) Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в герметическизакрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия

3) Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со

строгими аэробами

Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1см. Получается 2 агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

4) Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза

Работа №3 Культивирование вирусов

Для культивирования вирусов используют:

1) Куриные эмбрионы. Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов с целью получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептичных условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость отверстие заливают парафином; если материалом заражают хорионаллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорионаллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагии.

2) Культуру клеток (тканей). Клетки получают из тканей животных и человека. Их делят:

- на первичные, которые используют в течение одной генерации. Первичные клетки получают из эпителиальной или соединительной ткани. Они растут в суспензии, при оседании прочно прикрепляются к стенке флакона или пробирки в виде монослоя.

- полуперевиваемые сохраняются в течение 50 пассажей или года. Они относятся к соматическим диплоидным клеткам человека, которые не претерпевают злокачественного перерождения.

- перевиваемые, которые длительное время размножаться invitro. Однослойные культуры клеток готовят из нормальных, чаще эмбриональных линий клеток (клетки амниона человека, почек обезьяны) и злокачественных линий клеток (злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карценомы шейки матки, Hep - 3 из лимфоидной карценомы).

Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается цитопатическим действием (ЦПД); которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса

3) Лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и т.д.). Их используют для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделение вирусов. Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста. Репродукция вируса сопровождается клиническими проявлениями болезни или гибелью животного

Дата добавления: 2015-12-15 | Просмотры: 427 | Нарушение авторских прав