Реакции с участием меченых антигенов или антител
Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.
Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае - противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.
Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.
Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем - флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.
При использовании этого метода можно иметь одну флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.
1) Обнаружение антигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.
Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.
Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. В качестве
фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.
2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.
Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.
Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.
Результаты реакции учитывают, как указано выше.
В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.
Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.
ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.
Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем церено-
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 881 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 | 135 |
|