АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Подготовка питательной среды

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты). Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соедине­ний, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН₄), метанол (СНзОН) и углекислота (CCh), и кончая природными био­полимерами.

Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др). Как правило, эти компо­ненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные ком­поненты.

Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, сред­ствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройст­вами для приготовления растворов, суспензий и эмульсий. При этом все компоненты питательной среды хранятся обычно в твердом виде, а приго­товление их смеси в заданном соотношении производится в аппарате с мешалкой, куда они непосредственно поступают для последующего рас­творения. Иногда сначала в отдельных емкостях готовятся растворы каж­дого компонента, а потом производится их окончательное смешение.

Важнейшим элементом подготовки питательных сред является их сте­рилизация, поскольку выращивание промышленного микроорганизма должно проводиться, по крайней мере, в начальной стадии, в отсутствие посторонней микрофлоры. Это достигается путем предварительной стери­лизации всех потоков, поступающих на стадию ферментации.

Для стерилизации газовых потоков используют фильтрацию через спе­циальные волокнистые фильтры с определенным диаметром пор, которые задерживают клетки микроорганизмов из окружающей среды.

Все потоки могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.

Наиболее часто в промышленности используется термический метод. Он основан на губительном действии на живые клетки высоких темпера­тур. Основным недостатком термической стерилизации являются неиз­бежные потери питательных свойств среды. Наиболее часто в качестве источника углерода используются углеводы, которые не выдерживают на­гревания до высоких температур (120-150°С). Поэтому обычно источники углерода стерилизуют отдельно от растворов минеральных солей, обла­дающих большей термической устойчивостью.

Некоторые субстраты сами обладают способностью подавлять рост по­сторонних микроорганизмов, поэтому их стерилизации не требуется. К ним относятся, например, метанол, этанол, уксусная кислота и их концен­трированные растворы.

Остальные методы стерилизации применяются реже. Радиационный метод, основанный на облучении материалов большими дозами ионизи­рующих излучений (гамма-излучение), дает хорошие результаты. Однако он предполагает наличие мощных источников гамма-излучения. Поэтому радиационный метод используют для стерилизации небольших объектов, главным образом медицинского назначения (например, хирургический инструмент, перевязочный материал).

Химический метод стерилизации основан на использовании веществ, обладающих дезинфицирующим действием. Основной проблемой в этом случае является необходимость удаления стерилизующего агента из пита­тельной среды после подавления посторонней микрофлоры. Это может быть достигнуто путем его химического разложения с образованием не­токсичных для производственной культуры продуктов. К сожалению, чис­ло таких веществ очень невелико.

Фильтрационный метод основан на пропускании питательной среды че­рез специальные фильтры или мембраны, способные задерживать клетки микроорганизмов. Он наиболее пригоден для стерилизации питательных сред, которые не выдерживают действия высоких температур (молоко, растворы белков и др.). Основная трудность, возникающая при использо­вании этого метода, - необходимость стерилизации самого фильтрующего элемента, который не отличается достаточной термостойкостью.

1.2. Выращивание чистой культуры или получение посевного материа­ла

Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта. Поэтому очень важно сохранить на протя­жении длительного времени полезные свойства используемого штамма, который в дальнейшем используется для получения посевных доз, необ­ходимых для осуществления основной ферментации.

Все вышеизложенное требует организации на каждом биотехнологиче­ском предприятии условий для сохранения полезных признаков микроор­ганизма и отделения для выращивания чистой культуры.

Для любого микробиологического производства всегда необходима ис­ходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому любое предприятие в условиях собственной центрально-заводской лаборатории обновляет культуру пу­тем периодических пересевов на специально подготовленной среде и в дальнейшем организует ее хранение в холодильнике при температуре 3-4°С.

Для продолжительного хранения используют, в основном, следующие методы:

1) Хранение под слоем вазелинового масла.

Для этого выращенную в пробирках культуру заливают предварительно простерилизованным вазелиновым маслом на высоту слоя I см. Сохра­няемую таким образом культуру подвергают пересеву 1 -2 раза в год.

2) Хранение в ампулах в 10%-м растворе глицерина в атмосфере жидкого азота.

Возможный срок хранения составляет не более 5-ти лет.

3) Хранение в лиофильно-высушенном состоянии.

Для этого культуру в асептических условиях выдерживают при темпе­ратуре - 35°С, затем высушивают в вакууме, постепенно повышая темпе­ратуру до 20°С, в течение 25-30 часов. Ампулы запаивают. В таком виде культура может храниться в течение 5-6 лет без потери активности.

С учетом специфических свойств отдельных микроорганизмов допус­каются и другие способы хранения производственных штаммов. Так, стрептомицеты можно хранить на зерне или в стерильной почве.

Неотъемлемой частью работы отделения чистой культуры является проведение микробиологического и биохимического контроля.

Микробиологическому контролю исходная культура микроорганизма подвергается на всех стадиях производства. В ходе микробиологического контроля прежде всего проверяют чистоту культуры, а иногда и наличие типичных цитологических признаков. Присутствие хотя бы одной посто­ронней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбрако­вывает всю партию. Для спорообразующих культур единица массы посев­ного материала должна содержать требуемое количество спор.

Кроме того, в отделении чистой культуры осуществляют микробиоло­гический контроль воздуха, стен, поверхностей используемого оборудова­ния.

Целью биохимического контроля является определение концентраций расходуемого субстрата или получаемого продукта. В производстве вто­ричных метаболитов могут дополнительно контролироваться концентра­ции полупродуктов или предшественников их биосинтеза. Посевной мате­риал считается пригодным для засева в основной ферментер, если он обеспечивает на промышленной питательной среде близкие к паспортным данным концентрации целевого продукта.

В отделении чистой культуры производится накопление посевных доз производственной культуры.

Поскольку количество засевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объе­ма среды культивирования в нем, то накопление производственной куль­туры проводят 2-6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Число пересевов не может быть выше 6-ти, посколь­ку увеличивается риск обсеменения производственной культуры и ее вы­рождения. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1108 | Нарушение авторских прав