Подготовка питательной среды
Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты). Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН4), метанол (СНзОН) и углекислота (CCh), и кончая природными биополимерами.
Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др). Как правило, эти компоненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные компоненты.
Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий и эмульсий. При этом все компоненты питательной среды хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси в заданном соотношении производится в аппарате с мешалкой, куда они непосредственно поступают для последующего растворения. Иногда сначала в отдельных емкостях готовятся растворы каждого компонента, а потом производится их окончательное смешение.
Важнейшим элементом подготовки питательных сред является их стерилизация, поскольку выращивание промышленного микроорганизма должно проводиться, по крайней мере, в начальной стадии, в отсутствие посторонней микрофлоры. Это достигается путем предварительной стерилизации всех потоков, поступающих на стадию ферментации.
Для стерилизации газовых потоков используют фильтрацию через специальные волокнистые фильтры с определенным диаметром пор, которые задерживают клетки микроорганизмов из окружающей среды.
Все потоки могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.
Наиболее часто в промышленности используется термический метод. Он основан на губительном действии на живые клетки высоких температур. Основным недостатком термической стерилизации являются неизбежные потери питательных свойств среды. Наиболее часто в качестве источника углерода используются углеводы, которые не выдерживают нагревания до высоких температур (120-150°С). Поэтому обычно источники углерода стерилизуют отдельно от растворов минеральных солей, обладающих большей термической устойчивостью.
Некоторые субстраты сами обладают способностью подавлять рост посторонних микроорганизмов, поэтому их стерилизации не требуется. К ним относятся, например, метанол, этанол, уксусная кислота и их концентрированные растворы.
Остальные методы стерилизации применяются реже. Радиационный метод, основанный на облучении материалов большими дозами ионизирующих излучений (гамма-излучение), дает хорошие результаты. Однако он предполагает наличие мощных источников гамма-излучения. Поэтому радиационный метод используют для стерилизации небольших объектов, главным образом медицинского назначения (например, хирургический инструмент, перевязочный материал).
Химический метод стерилизации основан на использовании веществ, обладающих дезинфицирующим действием. Основной проблемой в этом случае является необходимость удаления стерилизующего агента из питательной среды после подавления посторонней микрофлоры. Это может быть достигнуто путем его химического разложения с образованием нетоксичных для производственной культуры продуктов. К сожалению, число таких веществ очень невелико.
Фильтрационный метод основан на пропускании питательной среды через специальные фильтры или мембраны, способные задерживать клетки микроорганизмов. Он наиболее пригоден для стерилизации питательных сред, которые не выдерживают действия высоких температур (молоко, растворы белков и др.). Основная трудность, возникающая при использовании этого метода, - необходимость стерилизации самого фильтрующего элемента, который не отличается достаточной термостойкостью.
1.2. Выращивание чистой культуры или получение посевного материала
Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта. Поэтому очень важно сохранить на протяжении длительного времени полезные свойства используемого штамма, который в дальнейшем используется для получения посевных доз, необходимых для осуществления основной ферментации.
Все вышеизложенное требует организации на каждом биотехнологическом предприятии условий для сохранения полезных признаков микроорганизма и отделения для выращивания чистой культуры.
Для любого микробиологического производства всегда необходима исходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому любое предприятие в условиях собственной центрально-заводской лаборатории обновляет культуру путем периодических пересевов на специально подготовленной среде и в дальнейшем организует ее хранение в холодильнике при температуре 3-4°С.
Для продолжительного хранения используют, в основном, следующие методы:
1) Хранение под слоем вазелинового масла.
Для этого выращенную в пробирках культуру заливают предварительно простерилизованным вазелиновым маслом на высоту слоя I см. Сохраняемую таким образом культуру подвергают пересеву 1 -2 раза в год.
2) Хранение в ампулах в 10%-м растворе глицерина в атмосфере жидкого азота.
Возможный срок хранения составляет не более 5-ти лет.
3) Хранение в лиофильно-высушенном состоянии.
Для этого культуру в асептических условиях выдерживают при температуре - 35°С, затем высушивают в вакууме, постепенно повышая температуру до 20°С, в течение 25-30 часов. Ампулы запаивают. В таком виде культура может храниться в течение 5-6 лет без потери активности.
С учетом специфических свойств отдельных микроорганизмов допускаются и другие способы хранения производственных штаммов. Так, стрептомицеты можно хранить на зерне или в стерильной почве.
Неотъемлемой частью работы отделения чистой культуры является проведение микробиологического и биохимического контроля.
Микробиологическому контролю исходная культура микроорганизма подвергается на всех стадиях производства. В ходе микробиологического контроля прежде всего проверяют чистоту культуры, а иногда и наличие типичных цитологических признаков. Присутствие хотя бы одной посторонней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбраковывает всю партию. Для спорообразующих культур единица массы посевного материала должна содержать требуемое количество спор.
Кроме того, в отделении чистой культуры осуществляют микробиологический контроль воздуха, стен, поверхностей используемого оборудования.
Целью биохимического контроля является определение концентраций расходуемого субстрата или получаемого продукта. В производстве вторичных метаболитов могут дополнительно контролироваться концентрации полупродуктов или предшественников их биосинтеза. Посевной материал считается пригодным для засева в основной ферментер, если он обеспечивает на промышленной питательной среде близкие к паспортным данным концентрации целевого продукта.
В отделении чистой культуры производится накопление посевных доз производственной культуры.
Поскольку количество засевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объема среды культивирования в нем, то накопление производственной культуры проводят 2-6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Число пересевов не может быть выше 6-ти, поскольку увеличивается риск обсеменения производственной культуры и ее вырождения. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м.
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1110 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 |
|