АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

При посіві штрихом

колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі розглядають колонії під лупою, малим чи вели­ким збільшенням мікроскопа. З підозрілих колоній готують мазки, фарбують за методом Грама для вивчення морфологічних та тинк-торіальних властивостей, досліджують рухомість бактерій у "вися­чій" чи "роздавленій" краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих мікроорганізмів.

Досліджувані колонії обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

На третій день досліджують характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторі-альних властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфо­логічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культу-ральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні. Найчастіше до­сліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, ката-лази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення

нітратів у нітрити, тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.

З метою встановлення видової належності бактерій часто вивча­ють їх антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антиген­ними властивостями. Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Зокрема, представники родини ентеробак-терій (ешеріхії, сальмонели, шигели) містять оболонковий О-анти-ген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Вони неоднорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сиро­ваток. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), а потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглюти­нації. Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності позитивної орі­єнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунту­ється на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим анти­токсичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лаборатор­них тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біоло­гічними властивостями. Як об'єкти найчастіше використовують гві­нейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар). Для цього на поверхню спеціального щільного

живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру мікроор­ганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіоти­ками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіоти­ками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: "Виділено Ез-сЬегісЬіа соїі" або "Виділений збудник належить до виду ЗїарЬуІо-соссиз ерісіегтісііз".

При виділенні та ідентифікації 5. аигеиз, 3. їурЬі та деяких інших мікроорганізмів визначають фаготип мікробів. З цією метою на жи­вильне середовище засівають чисту культуру бактерій і після підсу­шування чашки капають на її поверхню різні бактеріофаги. Після добової інкубації на поверхні середовища спостерігають за утворен­ням зон лізису бактерій (так звані, "негативні" колонії). Враховуючи, що чутливість до фагів досить-таки постійна ознака збудників, визначають їх фаготип. Співставляючи фаготипи мікробів, які виділе­но від хворих, з фаготипами тих, що виділено від носіїв або інших об'єктів, встановлюють джерело інфекції.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій. В лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікроорганіз­мами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, частіше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають при­пинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними складніша, вимагає значної уваги бактеріо­логів і лаборантів.

Враховуючи сучасний розвиток мікробіологічної науки, виділяти та ідентифікувати культури анаеробних мікроорганізмів можна ана­логічно аеробним бактеріям. Незаперечною умовою є обов'язкове дотримання на всіх етапах дослідження анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему "С-аз-Раск".

Однак збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції можна виділяти та ідентифікувати за дещо іншою схемою, не вико­ристовуючи занадто складних живильних середовищ.

На першому етапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості клінічного матеріалу, роблять мазок та фарбують його

за методом Грама. Після цього його засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Середовища ставлять у термостат при температу­рі 37 °С і культивують 1-3 доби.

На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помут­ніння, утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пепто-нізація молока). Готують мазок, фарбують за методом Грама і прово­дять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольованих колоній.

За методом Вейнберга готують декілька пробі­рок (3-4) з розтопленим і охолодженим до 42-45 °С цукровим м'ясо-пептонним агаром. Матеріал із середовища Кітта-Тароцці вносять у першу про­бірку за допомогою пастерівської піпетки й ре­тельно перемішують, потім переносять у другу, а далі - в третю (рис. 28). Після застигання агару пробірки культивують при оптимальній темпе­ратурі, і за деякий час спостерігають утворення ізольованих колоній. Однак вміст кожної пробірки можна всмоктати у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи щоб не було бульбашок повітря. Останні мають довжину біля ЗО см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того, щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею і переносять у відповідне середовище. Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера мате­ріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі його пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров'яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають на другу чашку, а потім і третю. На останній чашці виростають ізольовані колонії. Чашки пере­вертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в якому створюють анаеробні умови, а потім - у термостат при температурі 37 °С на 2-3 доби.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках

Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, харак­тер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфо­логічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов'язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабора­торних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.

Практична робота

1. Ознайомитись із набором основних компонентів для приготування простих і складних живильних середовищ (м'ясна вода, пептон, хлорид натрію, агар-агар, сухі середовища).

2. Ознайомитись із готовими живильними середовищами (МПБ, МПА, кров'яний агар, згорнута сироватка, Ендо, Левіна, Плоскирєва).

3. Вивчити ознаки росту мікробів на живильних середовищах.

4. Зробити мазки із суміші мікроорганізмів, забарвити їх за методом Грама і розглянути під мікроскопом.

5. Суміш бактерій засіяти на щільне живильне середовище петлею, тампоном і за допомогою шпателя.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 801 | Нарушение авторских прав