АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Складні методи забарвлення

При складних методах, які ще називають диференціально-діагнос­тичними, використовують декілька різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості хімічного складу клітини або наяв­ність у неї певних структур.

Для фарбування беруть розведені водно-спиртові або водно-фено­лові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.

Забарвлення мікроорганізмів за методом Грама. Метод Грама є найважливішим методом забарвлення мікробів і виявлення їх тинк-торіальних властивостей. Він дозволяє поділити мікроорганізми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці

трапляються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризуються як грамваріабельні.

Метод було розроблено Кристіаном Грамом у 1884 р. Однак до цього часу остаточно не з'ясовано механізми різного забарвлення мікроорганізмів. Вважають, що така здатність пов'язана з відміннос­тями у будові пептидоглікану в клітинній стінці грампозитивних бактерій, наявністю тейхоєвих кислот, вищою, порівняно з грамнега-тивними, концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнат магнію в клітині, співвідношенням РНК:ДНК в цитоплазмі (у грампози­тивних 8:1, а грамнегативних 1:1), а також більш кислим значенням рН в ізоелектричній точці цитоплазми.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних бактерій здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарв­люються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.

Грампозитивними є стафілококи, стрептококи, пневмококи, сар-цини і монококи, бацили і клостридії, а також дифтерійні та тубер­кульозні палички. Грамнегативні - гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.

Методика забарвлення полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв (у модифікації Синьова використовують суху полоску фільтрувального паперу, заздалегідь просочену 1 % спиртовим розчином кристалвіолету і висушену, на яку наливають 2-3 краплі води).

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують (рис. 13, вкл.).

Фарбування кислотостійких мікроорганізмів за методом Ціля-Нільсена. Деякі бактерії (збудники туберкульозу, лепри, актиномі­цети) в цитоплазмі містять багато жироподібних речовин, вищих ненасичених жирних кислот, воскоподібних субстанцій, тому вони погано знебарвлюються сумішшю кислота - спирт або окремо

кислотою після забарвлення гарячим розчином карболового фук­сину. Такі мікроорганізми належать до кислотостійких, а для їх виявлення використовується спеціальний метод забарвлення Ціля-Нільсена.

На фіксованй мазок, виготовлений з мокротиння хворого на тубер­кульоз, кладуть листочок фільтрувального паперу, на який наносять карболовий концентрований фуксин Ціля. Препарат тримають пінце­том і тричі прогрівають у полум'ї пальника до появи пари, кожний раз остуджуючи і додаючи нову порцію барвника. Папірець знімають, а препарат промивають водою і опускають 2-3 рази в стаканчик з 5 % сірчаною кислотою або наливають цей розчин на мазок для зне­барвлення. Знову ретельно промивають препарат водою і зафарбову­ють 3-5 хв розчином метиленового синього, промивають водою, висушують і мікроскопують.

Кислотостійкі палички забарвлюються в рубіново-червоний ко­лір, інші бактерії та фон - у голубий (рис. 14, вкл.).

Методика виявлення капсул. Виявлення капсул у мікрооганізмів має важливе діагностичне значення. Можна спостерігати капсули у Живих бактерій. Для цього краплю суспензії мікробів наносять на предметне скло, додають краплю насиченого 3 % водного розчину конго червоного. Змішавши дві краплі разом, частину суміші наносять на чисте предметне скло і опускають на нього покривне скельце, стежачи за тим, щоб не було повітря. Надлишок рідини відсмоктують фільрувальним папером, придавлюючи скельце до предметного. Внаслідок утворення капілярного шару фарби і розміщення мікро­організмів в один шар при мікроскопії неімерсійним або імерсійними об'єктивами спостерігають живих бактерій і утворення прозорих ореол капсул навколо них.

За методом Бурріна середину предметного скла наносять краплю туші та змішують її з краплею культури капсульних мікроорганізмів. Роблять мазок шліфованим ребром предметного скла, висушують і мікроскопують. На темному фоні видно й ободок капсули навколо незабарвлених мікробів.

Використовуючи метод Буррі-Гінса мазок роблять за методом Буррі, фіксують метиловим спиртом або полум'ям і після промиван­ня водою забарвлюють 5-10 хв карболовим розчином фуксину Ціля, розведеним 1:3 або тіоніном. Препарат промивають водою, висушу­ють і мікроскопують. На темному фоні спостерігають забарвлені в червоний або синій колір мікроорганізми, оточені світлим ободком -капсулою (рис. 15, вкл.).

Методика виявлення спор. На незафарбованому препараті ен-доспори живих бактерій мають чорні краї та яскраво світяться у площині, дещо вище положення справжнього фокуса.

При використанні негативного контрастування 7 % розчин вод­ного нігрозину змішують на покривному скельці з петлею культури, роблять тонкий мазок, який висушують на повітрі. Покривне скельце перевертають мазком донизу, кладуть на предметне скло, фіксуючи його воском або вазеліном. Ендоспори видно як сферичні або еліпсо-видної форми об'єкти, які сильно заломлюють світло.

За методом Ожешко на нефіксований препарат наливають 0,5 % розчин хлористоводневої кислоти і підігрівають 1-2 хв на полум'ї. Піля цього з препарата зливають рештки кислоти, промивають водою, після висихання фіксують у полум'ї та забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори набувають червоного кольору, а тіла мікробних клітин - голубого (рис. 16, вкл.).

Методика виявлення джгутиків. Процес забарвлення джгутиків складний і вимагає особливої ретельності від мікробіолога, оскільки товщина джгутика (10-30 нм) менше роздільної здатності мікроскопа, і щоб їх розглянути, потрібно в першу чергу штучно збільшити їх діаметр.

Скельця для препарата повинні бути абсолютно чистими та зне­жиреними. Як правило, використовують нові скельця після відповід­ної обробки.

Принцип методу Леффлера полягає в тому, що петлю 18-годинної агарової культури мікробів змішують із водопровідною водою і обе­режно відтягнутим кінцем пастерівської піпетки наносять декілька крапель суспензії (5) на поверхню покривного скельця, висушують і швидко проводять через полум'я пальника. На фіксований препа­рат наливають протраву і залишають її на 10-15 хв. Протрава скла­дається з насиченого спиртового розчину основного фуксину, 20 % водного розчину таніну й насиченої на холоді солі Мора (сірчанокис­ле закисне аміачне залізо). Після цього препарат промивають дисти­льованою водою і забарвлюють карболовим фуксином Ціля 2-5 хв. Препарат знову промивають водою, висушують і мікроскопують.

Методика фарбування включень у бактерій. За методом Нейссера для виявлення волютинових зерен у коринебактерій і, зокрема, в дифтерійних паличок, на фіксований препарат на 1-2 хв наносять краплю оцетовокислого метиленового синього (барвник Нейссера),

а потім рознин Люголя на 10-30 с. Промивають препарат водою та забарвлюють водним розчином везувіну або хризоїдину протягом 1 хв і знову промивають водою та висушують. Тіла бактеріальних клітин фарбуються в ніжно-жовтий колір, зерна волютину - в темно-синій (рис. 17, вкл.).

За методом Леффлера препарат фарбують протягом 10-30 с лужним метиленовим синім, промивають водою, висушують і мік­роскопують. Гранули поліфосфатів виглядають як кульки синього або фіолетового кольору, а цитоплазма забарвлюється у світло-голубий (рис. 18, вкл.).

Методика виявлення ядерної субстанції. З цією метою використо­вують метод Лікарського. Фіксований метиловим спиртом або су­мішшю Нікіфорова препарат обробляють Ш розчином соляної кис­лоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильо­ваною водою, висушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбу­ються в темно-червоний, а цитоплазма клітин - у рожевий колір.

Практична робота

1. Виготовити мазок із суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій (стафілококів і кишкових паличок) і забарвити за методом Грама.

2. Забарвити мазки з мокротиння хворого на туберкульоз за методом Ціля-Нільсена.

3. Готовий препарат з Сжтеріями, що мають волютинові зерна,
забарвити за методами Нейссера і Леффлера.

4. Демонстрація мікроорганізмів, що утворюють спори і капсули.

Питання для самоконтролю

1. Сучасна класифікація й номенклатура бактерій.

2. Які суттєві ознаки еукаріотів і прокаріотів?

3. Поділ кулястих і паличкоподібних бактерій за іх розташуванням у препаратах-мазках.

4. Патогенні для людини звивисті форми. Які захворювання вони викликають?

5. Структура оболонки грампозитивних і грамнегативних клітин, їх нуклеоїду, цитоплазми та її включень. Методи виявлення структур бактеріальної клітини.

6. Що таке протопласти, сферопласти, Ь-форми бактерій?

7. Капсули, спори, джгутики, спори бактерій, іх будова та методи виявлення.

8. Особливості будови актиноміцетів, спірохет, рикетсій, хламідій, мікоплазм, найпростіших та грибів. Захворювання, які вони викликають у людини.

Ситуаційні задачі

1. Після чотирьох етапів забарвлення за методом Грама в модифікації Синьова препарата з мікроорганізмів у мазку не видно ніяких бактерій. Як вони забарвляться за Грамом після п'ятого етапу?

2. При забарвленні за методом Ціля-Нільсена під мікроскопом видно синього кольору мікроорганізми. Як оцінити їх кислотостійкість?

3. Виберіть, які бактерії утворюють капсулу:

а) пневмококи;

б) гонококи;

в) збудники сибірки;

г) кишкова паличка;

д) сальмонели.

Відповіді

1. Бактерії будуть червоними, тобто грамнегативними.

2. Мікроорганізми кислотонестійкі. З.А,в.

Розділ 3. ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.

Бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмно­ження, продукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональної активності клі­тин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовніш­нього середовища.

Хімічний склад бактерій

Як і всі живі істоти, бактерійна клітина складається з чотирьох основних елементів - азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає 45-55 % сухого залишку клітини, кисень - 25-30 %, азот - 8-15 % і водень - 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з якого побу­довано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.

Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. Вона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або зв'язаному стані. Вільна вода є середовищем, в якому відбувається розмаїття біохі­мічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) внаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона виступає розчинником багатьох речовин, що надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.

Зв'язана вода - також необхідний компонет цитоплазми, проте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призво­дить до її загибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає виходити з неї, цитоплазма зморщується, відшарову­ється від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.

Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, вуглеводів, полісахаридів, низько­молекулярних органічних речовин і солей.

Білок складає до 55 % сухого залишку клітини. Його представ­лено простими та складними білками. Прості білки називають протеїнами. За своїм складом вони суттєво не відрізняються від

білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса міститься в цито­плазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці грамне-гативних мікробів, нуклеоїді. Токсини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза є простими білками.

Складні білки - протеїди свою назву отримали за здатність сполу­чатися з іншими речовинами. Так, білки, зв'язані з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами - гліко-нротеїди, ліпідами - ліпопротеїди, залізом, міддю - хромопротеїди. Вони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нук­леопротеїди забезпечують суперспіралізацію нуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й вико­нують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; ліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бакте­ріальних ендотоксинів, отже, вірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну функцію клітини, є переносниками кисню.

Тонкі фізико-хімічні дослідження дозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів.

Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою (ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. їх вміст коливається в межах 25-30 % сухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, транспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК - форма, що утворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної інформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. Рибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від РНК еукаріотів за константою седиментації. Транспортні РНК здатні зв'язуватись із амінокислотами, що накопичуються в цито­плазмі, й доставляти їх до рибосом, на яких відбувається процес біосинтезу.

Вуглеводи становлять 12-20 % сухого залишку. їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, оліго- та поліо-зидами, полісахаридами, іншими сполуками. їх роль у забезпеченні життєдіяльності клітини важко переоцінити, так як вони входять до складу будь-яких структур клітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. Полісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони зумовлюють

нтигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) ластивості. Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли в основу озробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. Особли-ості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вак-ини, специфічні діагностичні сироватки. У клітині міститься в середньому до 10 % ліпідів. Однак в окремих зуп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується о 40 %. У грамнегативних бактерій в зв'язку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 разів більше, ніж у грампозитивних.

В середньому в клітині є до 22 млн молекул різноманітних ліпідів. Представлено їх, в основному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних кислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні властивості клітини (кисло­тостійкість), її токсичні функції, беруть участь у метаболізмі.

Важливою складовою частиною будь-якої мікробної клітини є міне­ральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і можуть знаходитись у вільному стані в цитоплазмі. Без них не обхо­дяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у мікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх похідні за рахунок вдатності утворювати макроергічні (багаті на енергію) зв'язки постача­ють клітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєді­яльності бактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й кальцій здатні активувати багато ферментів; залізо -Невід'ємний складник цитохромів.

Клітинний метаболізм

Сукупність усіх біохімічних перетворень у клітині називається мета­болізмом. Він відбувається за двома основними напрямками. Перший яабезпечує синтез складних клітинних сполук із більш простих. Тому ІІн одержав назву біосинтез, конструктивний метаболізм або анабо­лізм. Однак переважна більшість реакцій синтезу й розпаду потребує енергетичного забезпечення. Тому енергетичний метаболізм або ката­болізм представляє собою потік реакцій, які супроводжуються накопи­ченням електрохімічної енергії, що потім використовується клітиною.

Конструктивний та енергетичний метаболізм - тісно пов'язаний Між собою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і

одні й ті ж речовини використовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи - амфі-болічними.

Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. Вони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для побудови власних структур. Саме цим зумовлюється убіквітар-ність їх розповсюдження.

Конструктивний метаболіз прокаріотів. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись постійний обмін речовин з навко­лишнім середовищем. У клітину ззовні мусить надходити пластичний матеріал, з якого вона синтезує всі необхідні їй молекули.

У конструктивному метаболізмі провідна роль належить сполу­кам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. Залежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві гру­пи: автотрофи і гетеротрофи.

Автотрофи (аиіоз - сам, ІгорЬе - живлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з С0₂ як єдиного джерела вуглецю. Гетеротрофи (Ьегегоз - інший) - мікроорганізми, джерелом вуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні споживати будь-які прості й складні вуглецеві сполуки - цукри, амінокислоти, багатоатомні спирти, парафіни та ін.

Ступінь вираження гетеротрофії у бактерій може бути найрізно­манітніша. Найвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити тільки всередині живих клітин (рикетсії, хламідії). їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі мікроорганізми називають облігатними (суворими) паразитами.

Однак багато мікробів можна вирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, пептиди, вітаміни, фраг­менти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних рости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, назива­ють факультативними паразитами.

Більшість бактерій, що населяють земну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих організмів не залежать і живляться за рахунок мертвих органічних залишків.

Мікроорганізмам необхідний азот для синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні бактерії здатні за­своювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), інші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило, засвоюють азот у відновленій формі - це солі амонію, сечовини, органічні

сполуки (амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) також можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони відновлюються до аміаку за допомогою ферментів нітратредук-тмзи й нітрилгредуктази.

Дикі штами бактерій здатні синтезувати всі необхідні їм речовини и обмеженого числа органічних сполук, наприклад, глюкози та солей имонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми (ва­ріанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних їм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живиль­них середовищах. їх називають ауксотрофними організмами.

Джерела енергії та донори електронів. Залежно від джерела енергії, що засвоюють мікробні клітини, їх поділяють на фототрофи іхсмотрофи.

Фототрофні бактерії здатні використовувати енергію сонячного снітла. їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патоген­них для людини серед них немає. Інші прокаріоти, які одержують анергію за рахунок окисно-відновних реакцій в субстратах, назива­ються хемотрофами.

Для здійснення різноманітних реакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних перетворень віддають електро­ни, називаються донорами. Молекули, які одержують електрони, Називаються акцепторами.

Мікроорганізми, для яких джерелом електронів є неорганічні сполуки типу Н₂, Н₂5, N13^, Ре ⁺² та інші, називаються літотрофами (Іііоз - камінь). Інші бактерії, для яких донором електронів виступають органічні речовини, називаються органотрофами.

Залежно від способу одержання енергії, донора електронів та дже­рела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 основних типів прока-ріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й фотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, хемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемоорганоавтотрофи й хемоорганогетеро трофи.

Мікроорганізми, які здатні викликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів.

Бактерії, яким притаманний один із спосібів живлення, позначають ик облігатні, а ті, які використовують два джерела енергії, - міксотрофи.

Для здійснення своїх метаболічних перетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні сполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн),

вітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору неможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він необ­хідний компонент фосфоліпідів, коферментів.

Мікроорганізми засвоюють сірку з природних джерел, де вона знаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної сірки, а потреби у фосфорі задовільняються за рахунок засвоєння неорганічних фосфатів.

Усі необхідні йони металів клітина одержує за рахунок неорганіч­них сполук. Деякі елементи (магній, кальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в інших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у клітині надзви­чайно різноманітна, так як вони входять до складу основних клітинних метаболітів, виконуючи життєво важливі функції.

При культивуванні бактерій крім білків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього середовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів росту. Вони включаються до складу клітинних метаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі вітаміни (біотин, тіамін, пантотенова кислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та піримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.

Надходження речовин у клітину. Незважаючи на досягнення мік­робіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клі­тині остаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення метаболітів назовні не з'ясовано. Встановлено, що мікробам притаманний голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні речовини тільки в розчиненому вигляді.

Однак деякі субстрати не розчиняються у воді (білки, полісахари­ди), або утворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому випадку клітинні екзоферменти, які виділяються в навко­лишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплю­ючи їх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.

Виділяють декілька механізмів проникнення речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли створюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та зовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії. Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків - пермеаз, які містяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає

ічіергетичного забезпечення. Однак більшість поживних речовин, метаболітів, іонів проникають у клітину за допомогою активного транспорту. Його також забезпечують білки-пермеази, але вони є цисокоспецифічними й здатні переносити тільки певні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує клітина, тому можливий перенос і проти градієнта концентрації речовини. Як­що цьому процесу передує певна хімічна модифікація молекули, Його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також меха­нізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних іонів.

Конструктивний метаболізм. Обмін білків у мікроорганізмів відбу-пається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до амінокислот і біосинтетичні процеси, пов'язані з конструюванням нових молекул. Перший напрямок забезпечують ферменти екзопро-тоази, що виділяються в навколишнє середовище, та ендопротеази, лкі нагромаджуються в клітині. Кінцеві продукти - амінокислоти, -що утворюються під час цього процесу, можуть зазнавати дезаміну­вання та декарбоксилювання, перетворюючись на аміак, вуглекислий Газ, оксикислоти.

Біосинтетичні процеси відбуваються за участю готових амінокис­лот, які трансамінуються або переамінуються. Деякі мікроорганізми идатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно назначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму люди­ни, здатні синтезувати незамінні амінокислоти - лізин, метіонін, триптофан.

Вуглеводний обмін забезпечуєтея або гідролітичним розщеплен­ням молекул з утворенням глюкози й мальтози або фосфоролізом. І і» одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються вивіль­ненням енергії. Це відбувається при бродінні - окисновідновних реак­ціях анаеробного розщеплення органічних речовин, головним чином, нуглеводів. Метаболіти, які утворюються під час бродіння, використо-иуються для біосинтетичних процесів. Продуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, мурашина), спирти (ети­ловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, еодєнь. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, розрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види бродіння. При бродінні вивільняється незначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 молекулу субстра­ту утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).

Синтез вуглеводів відбувається або з вуглекислого газу (автотро­фи), або за рахунок вуглецемістких органічних сполук.

Як було зазначено, ліпіди мікроорганізмів представлено насичени­ми та ненасиченими жирними кислотами, фосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. Мікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за участю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою клітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включа­ються до складу фосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших ліполітичних ферментів.

Ферменти мікроорганізмів. Усі біосинтетичні процеси та інші метаболічні перетворення в клітині відбуваються за участю особливих високоактивних біологічних каталізаторів, які називаються фермента­ми. Вони належать до 6 класів: гідролази (забезпечують реакції роз­щеплення за участю води), оксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть участь у процесах дихання), ізомера-зи (здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси ізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних субстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеп­лення хімічних груп негідролітичним шляхом), лігази (відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахунок енергії АТФ).

Здатність утворювати певні ферменти кодується клітинним гено­мом і є постійною ознакою бактерій. Так як бактеріальна клітина зай­має невеликий об'єм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів синтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої групи постійно присутні в бактерії в певних концентраціях. Вони зумовлюють першо­чергові біосинтетичні потреби клітин.

Клітина виділяє ферменти в навколишнє середовище (екзофер-менти). Там вони здійснюють контактне позаклітинне перетравлюван­ня речовин або пошкоджують тканини організму господаря. Ендофер-менти локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в периплазма-тичному просторі.

Роль ферментативної діяльності мікроорганізмів важко переоціни­ти. Вони мають загальнобіологічне значення. Відома участь бактерій у кругообізі речовин у природі, формуванні родовищ корисних копа­лин (нафта, вугілля, поклади сірки). Мікроорганізми - прекрасні санітари довкілля. Вони здатні біодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє середовище.

Людина поставила мікробні ферменти собі на службу. їх широко використовують у різних галузях хімічної, харчової, фармацевтич­ної, парфумерної промисловостей, сільському господарстві, медицині.

Протеазами видаляють волосяний покрив зі шкір тварин, зніма­ють желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що забезпечують бродіння, використовуються для одержання бутанолу, ацетону, необ­хідних для проведення хроматографічних досліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти - кефір, йогурт, кисляк, кумис - також продукти діяльності бактерій бродіння.

Мікроорганізми використовуються у виноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла, силосуванні кормів, ква­шенні овочів. Із дріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як живильне середовище використовують парафіни - відходи нафти.

За допомогою мікроорганізмів та їх ферментних систем в медичній промисловості одержують гормони гідрокортизон, преднізолон, різ­номанітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують віта­міни (В₁₂). Зі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу 1 стрептокіназу, які руйнують тромби в кровоносних судинах.

Оскільки здатність утворювати ферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко використовується в ла­бораторній практиці для ідентифікації бактерій. її проводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, ліполі­тичних та інших ферментів.

Енергетичний метаболізм прокаріотів. За своїм об'ємом реакції, що забезпечують клітину внутрішньою енергією, значно перевищу­ють біосинтетичні процеси.

Мікроорганізми можуть використовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні користуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтєзуючі бактерії) та хімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова енергії.

Явище нагромадження енергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту протонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, а електрони передаються на відповідні молекули-акцептори.

Протягом своєї еволюції бактерії виробили три способи одержан­ня енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.

При бродінні в анаеробних умовах у певних окислювально-віднов­них реакціях утворюються нестабільні молекули, фосфатна група

яких містить багато вільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти (АДФ), яка перетворюється в АТФ. Реакції, в яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстрат-ного фосфорилювання. Відновлювач, який при цьому утворюється, (НАД.Н₂, відновлений фередоксин), переносить електрони на ендо­генний акцептор (піруват, ацетальдегід) або звільняється у вигляді водню.

Окислення відбувається внаслідок переносу електронів через спе­ціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембра­ні. Він складається з набору переносників і в більшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до Н О.

Основою фотосинтетичних процесів у представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними пігментами: флавопроте-їнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять негемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення енергії.

Енергія, яку генерує клітина, запасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню - Ацн⁺ або в молекулах АТФ.

Прокаріоти містять декілька сполук із високоенергетичними фос­фатними зв'язками - ацилфосфати, фосфоенолпіруват, аденозинфос-фосульфат, а також сполуки з тіоефірним зв'язком - ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. Перенос її веде до розриву зв'язку, з'єднуючого з молекулою, отже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєд­нання такої групи до молекули акцептора підвищує рівень його віль­ної енергії, переводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних реакціях.

Найголовніше місце в переносі хімічної енергії йалежить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та мембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється фосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергіч-них зв'язки, які при гідролізі звільняють 31,8 кДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі розміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки клітини, де необхідна енергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля 10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.

На прикладі Е. соїі визначено, скільки необхідно енергії, щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль АТФ,

із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль - на синтез ДНК і РНК, 2 ммоль - для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання життєдіяльності - осмос, рух клітини тощо.

Іншою універсальною клітинною енергією є енергія трансмембран­ного потенціалу Дцн⁺. Це здійснюється за допомогою спеціальної "петлі", локалізованої в цитоплазматичній мембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої сторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а протони вивільняються в зовнішнє середовище.

При такому переносі назовні клітини накопичуються іони водню, середовище "підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває більш лужного характеру. Виникає орієнтований попе­рек ЦПМ градієнт іонів водню. Оскільки Н⁴ - хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення з обох сторін ЦПМ викликає створення не тільки концентраційного градієнта часток, але й орієн­тованого поперек мембрани електричного поля. Напруга потенціалу Д|дн⁺ досягає 200-250 мВ.

Енергія трансмембранного потенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного АТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного фосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може проходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідро­лізі АТФ зростає енергія Д(ін⁺ на ЦПМ.

Таким чином, дані реакції є природними механізмами, які з'єдну­ють процеси окислення з фосфорилюванням. Енергія, яка накопичу­ється на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні потреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює рух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та іонів через мембрану, а енергія АТФ - синтетичні процеси в клітині.

Але ні енергія Ацн⁺, ні АТФ не можуть нагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже тривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії прокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахари­дів, ліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, вкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

Дихання бактерій

Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони від­новлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі кисню. У 1863 р. він запропонував терміни "аероб" та "анаероб".

Сьогодні, залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп. Облігатні аероби - мікроорга­нізми, для оптимального росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На по­верхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки. Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при від­сутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спе­ціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких ство­рюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентними газами (азотом, воднем). Факультативні анаеро­би (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середо­вища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та нав­паки. Групу факультативних анаеробів формують численні представ­ники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бакте­ріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представни­ками є збудники бруцельозу бичачого типу.

В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцеп­тор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. У клітинах факультативних анаеробів також є цито-хромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталі­зують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

Детальне' вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб відбу­лось переключення механізму бродіння на аеробне дихання, достат­ньо було 0,2 % кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв'язана.

Ріст і розмноження бактерій

Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Підростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і від­повідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження - це здат­ність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю об'єму середовища

Розмноження бактерій - складний процес, пов'язаний із синхрон­ною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу - ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається, реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівкон-сервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої в місці з'єднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розхо­дяться. Кожна з них є матрицею, на якій за принципом комплемен-тарності синтезуються їх копії, які згодом об'єднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис нуклеотидів, які пізніше зшиваються фермен­том лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.

Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона

■

оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перего­родки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складати­муться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних мікробів синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають зв'язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм.

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий -такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип - із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому утворюються багато-нуклеоїдні форми бактерій.

Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбу­вається в різних площинах. Це спричиняє, наприклад, утворення різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів - диплоко­ків, стафілококів, тетракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмно­жуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення клітин, подібних до спор, конідій.

Облігатні внутрішньоклітинні паразити - хламідії - розмножу­ються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується нове покоління елементарних тілець. Тривалість циклу складає 40-48 годин.

Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні.до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись і простим бінарним поділом.

Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факто­рів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окис­но-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні ЗО хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 -мільйони. Через 35 год їх об'єм становитиме до 1000 м³, а маса -понад 400 т.

При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, дося­гаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти

обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періо­дичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з генетично обмеженим ростом.

Крива, яка описує за­лежність логарифму чис­ла живих клітин від часу культивування, назива­ється кривою росту.

Розрізняють чотири основні фази росту періо­дичної культури: почат­кову (або лаг-), експо­ненціальну (або логариф­мічну), стаціонарну та відмирання (рис. 19).

Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бак­терій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.

Експоненціальна (логарифмічна) фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії. Вона залежить від віку мікробів і складу се­редовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи -ЗО хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час, протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази - 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збіль­шуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит жи­вильних речовин у середовищі, низький парціальний тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин познача­ють як максимальну (М-) концентрацію, а величину біомаси - термі­ном вихід або урожай. Ця ознака є специфічною й характерною для кожного виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних

речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом власних ферментів.

Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціального росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням живильного середовища, додат­ковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати - прилади, які дозволяють про­водити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах.

Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища.

Культивування мікроорганізмів

Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяль­ності мікроорганізмів.

В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тварин­ного походження (м'ясо яловиче, риба, м'ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використо­вувати й замінники м'яса - плаценту, кров'яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живиль­них речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати - кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, нат­рію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, акти­воване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середо­вища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну в'язкість, густину (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, про­зорими й обов'язково стерильними.

Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеці­альні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з'являються все нові й нові се­редовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі й щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морсь­ких водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м'язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманіт­них субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганіз­мів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи.

Перша група - універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м'ясо-пеп-тонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група - спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров'яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.

Третя група - елективні середовища. їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів. Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відріз­няють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера - для збудників дифтерії, середовище Плоскирева - для дизентерійних паличок, середовище Мюллера - для тифопаратифозних бактерій. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на середовищах, у складі яких є до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон.

Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група - диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пеп-толітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо.

На поверхні щільного живильного середовища
мікроорганізми можуть утворювати суцільний,
густий ріст або ізольовані колонії. Колонія -
це видимі неозброєним оком скупчення бактерій
на поверхні або в товщі живильного середовища.
Як правило, кожна колонія формується з нащад­
ків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад
_ «/ досить однорідний. Утворення її є проявом куль-

зі ЯГ ЛЦЦк. туральних властивостей бактерій.

^^^ "ЩИР Характеристика колоній - важлива складова

частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії (рис. 20).

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) вони поді-

ллються на великі (4-6 мм і більше), середні

(2-4 мм), дрібні (1- 2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, непра­вильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що про­пускають світло, і мутними.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусо­подібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладень­кою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як 8-форми (зтооІЇї -гладенький), а шорсткі - К-форми (гоидп - шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіаль­ну посмугованість тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, нитко­подібні і волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистен­цію: пастоподібна, в'язка або слизова, суха, крихка тощо.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в'язким, слизистим та ін. Середови­ще над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або жовту­ватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в'язку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

Морфологія й фізіологія вірусів

Віруси - особливий клас неклітинних форм життя, які вивчає самостійна галузь мікробіологічної науки - вірусологія. Відомо понад 2000 видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Віруси - убіквітарні істоти. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об'єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів були зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механіз­мів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалось грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають нам ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Вірусні хвороби людей, тварин, рослин - справжнє лихо людства. Відомо понад 500 вірусів, які викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, натуральна віспа, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД - ось тільки деякі захворювання, з якими людина повинна вести постійну боротьбу.

Слово "вірус" означає "отрута". Честь відкриття вірусів належить Д.Й. Івановському, який у 1892 р. описав вірус мозаїчної хвороби тютюну. У 1897 р. Леффлер і Фрош відкрили вірус ящура, а в 1917 р. Ф. д'Ерелль - бактеріофаги. Сьогодні віруси розглядають як неклітинні системи живих істот, які відрізняються своїми малими розмірами, відсутністю у віріоні білоксинтезуючих та енергієгенеруючих сис­тем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

Структура вірусів. Окрема вірусна частка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, - капсида (сарза -

вмістилище). Разом вони формують нуклеокапсид (рис. 21).

Капсиди утворюються з білкових субодиниць (поліпептидів), які назива­ються капсомерами. їх кількість ста­більна для кожного виду вірусів і ви­користовується як таксономічна ознака. Віруси з таким типом будови назива­ють простими. До них належать най-дрібніші з патогенних вірусів людини „ „, „

^ґ,/ ґис. 21. Схематична будова вірю-

ПОЛЮВіруси, а Також аденовіруси, _вя: а - нуклеїнова кислота; б - кап-
паповавіруси. сид; в - суперкапсид; г - шипики

Проте більшість вірусів має ще одну оболонку - суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками -глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стук-тури, що називаються шипами. Такі віруіи називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер (реріон - накидка). До них належать віруси віспи, герпесу, гепатиту В, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії зале­жить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розта­шування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубіч­ний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характе­ризується тим, що капсомери утворюють багатогранник (найчастіше ікосаедр - 20-гранник), симетричний у трьох взаємоперпендикуляр-них площинах (вісях симетрії). Усі відомі ДНК-місткі віруси мають ізометричні (складні) капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, віруси натуральної віспи), а також віруси, що містять РНК - пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, віруси грипу, кору епіде­мічного паротиту та ін.).

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких вірусів -збудників лейкозу, саркоми, бактеріофагів. При цьому нуклеокапсид має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у ньому, укладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна

(віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (деякі бактеріофаги), ниткоподібна (віруси грипу, віруси бактерій).

Розміри вірусів значно поступаються бактеріям, коливаючись у межах 20-400 нм. Визначити їх можна за допомогою електронного мікроскопа, ультрацентрифугування, а також при фільтруванні через спеціальні фільтри.

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів ле­жать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфо­логію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо. За наяв­ністю нуклеїнової кислоти їх поділяють на ДНК-місткі та РНК-міст-кі (або ДНК-геномні та РНК-геномні) віруси. Всередині цих груп розрізняють родини, підродини, роди та види. До ДНК-містких вірусів належать 7 родин: Рохуігісіае, Негрезуігісіае, Агіепоуігісіае, Рароуа-уігісіае, Нерастауігісіае, Рагуоуігісіае, Ігісіоуігігіае. РНК-місткі віруси формують 13 родин: Рісогпауігісіае, Саіісіуігісіае, Тодауігісіае, Иауі-уігійае, ОгШотухоУІгігїае, Рагатухоуігігіае, Агепауігіоіае, Согопа-уігійае, Випуауігісіае, Кеїгоуігісіае, Кеоуігісіае, КпаЬсІоуігісІае, Ріііоуігійае. їх детальна характеристика описана в 18 розділі.

Хімічний склад вірусів. До складу вірусів входить нуклеїнова кислота, білок, ліпіди, гліколіпіди, глікопротеїди. Вони завжди міс­тять один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 % до 40 % маси віріона. Вони характеризуються надзвичайним різномаїттям форм. Геном може бути представлений як односпіраль-ними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійними або фраг-ментованими. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для син­тезу лише декількох білків. їх маса сягає 10" мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина - до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус нату­ральної віспи).

Білки вірусів (70-90 %) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взає­модіють з мембранами чутливих клітин і забезпечують проникненя вірусу в клітину, мають РНК- та ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного генома, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у

віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2118 | Нарушение авторских прав