АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Занятие № 3. ферменты бактерий. выделение чистой культуры аэробов (III этап). методы выделения чистых культур анаэробов

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. В бактериальной клетке протекают многочисленные химические реакции, совокупность которых обеспечивает обмен веществ и энергии между бактериальной клеткой и окружающей средой, что является основой жизнедеятельности. Обмен веществ складывается из анаболических (синтетических) реакций и катаболических (распад веществ) реакций. Все эти реакции катализируются ферментами.

2. Ферменты – это биологические катализаторы. По химической природе они являются белками. Они обладают специфичностью действия, т.е. распознают свои, соответствующие им, субстраты и вступают с ними во взаимодействие. Ферменты отличаются чрезвычайно высокой активностью катализа (увеличивают скорость реакции в млрд. раз). Активность ферментов зависит от температуры, рН среды и других факторов. Оптимальное значение рН и температуры для роста микроорганизмов определяется суммарным влиянием этих факторов на сотни ферментативных реакций в клетке. Ферменты локализуются в клетке в соответствии с локализацией тех процессов, в которых они участвуют (компартментализация), и связаны с определенными структурами клетки. В ЦПМ находятся окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании, и транспортные ферменты, участвующие в питании (пермеазы). В клеточной стенке и лизосомах находятся ферменты, участвующие в делении клетки и аутолизе. С нуклеоидом связаны ферменты, участвующие в репликации ДНК.

Задача 2. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

- 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

- 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных функциональных групп (радикалов) и молекулярных остатков от одних соединений к другим;

- 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления (реже синтеза) веществ на более простые соединения с участием воды (т.е. реакции гидролиза);

- 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

- 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

- 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых.

2. Ферменты бактерий классифицируют также на экзо- и эндоферменты.

Эндоферменты катализируют метаболические процессы внутри клетки. Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Эти ферменты: а) участвуют во внеклеточном переваривании; они расщепляют макромолекулы питательных веществ до простых соединений (глюкозы, аминокислот, жирных кислот), которые могут проходить через оболочку клетки и с помощью пермеаз ЦПМ передаваться в цитоплазму клетки для участия в метаболизме; б) выполняют защитную функцию; например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий; они разрушают ткани и клетки, обусловливают распространение в инфицированной ткани микроорганизмов и их токсинов; к ним относятся:

- гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту – составную часть основного вещества соединительной ткани;

- дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;

- фибринолизин – расщепляет коллаген;

- плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;

- нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;

- лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

3. Ферменты бактерий классифицируются также на конститутивные и индуцибельные.

Конститутивные ферменты синтезируются в клетке с постоянной скоростью (непрерывно) вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде.

Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются в клетке только при наличии в среде субстрата данного фермента. Так, у E. coli увеличивается содержание b-галактозидазы при выращивании на среде с лактозой, т.е. происходит индукция синтеза фермента.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ПО БИОХИМИЧЕСКИМ (ФЕРМЕНТАТИВНЫМ) ПРИЗНАКАМ.

Для этого надо знать:

1. Ферментный состав микроорганизмов определяется геномом и является достаточно постоянным признаком, поэтому его определение важно для дифференциации и идентификации микроорганизмов. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

2. Различия в ферментном составе гидролаз определяют различия таких биохимических свойств бактерий, как: а) сахаролитические свойства – способность разлагать сахара; б) протеолитические свойства – способность расщеплять белки.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления: образование щелочей, H₂S, NH₃ при расщеплении белков; образование кислот, СО₂, Н₂ при сбраживании углеводов.

3. Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидаза – фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород в процессе аэробного дыхания. Активность ЦО учитывается при дифференциации бактерий сем. Enterobacteriaceae. Для обнаружения ЦО полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом (1 % спиртовой р-р a-нафтола и 1 % р-р N-диметил-р-фенилендиамин дигидрохлорида в соотношении 2:3) и наносят суточную культуру микроорганизмов. О наличии ЦО судят по синему окрашиванию.

4. Таксономическим признаком для микроорганизмов служит также способность восстанавливать нитраты в нитриты (для определения нитритов используют реактив Грисса), наличие бутандиолового брожения на среде Кларка, для выявления которого используется реакция Фогеса-Проскауэра на ацетоин – промежуточный продукт брожения.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР.

Для этого надо знать:

1. Сахаролитические свойства – это способность микроорганизмов ферментировать определенные углеводы с образованием органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО₂ и Н₂). Для многих микроорганизмов они служат таксономическим признаком.

2. Для определения сахаролитических свойств используются дифференциально-диагностические среды – жидкие и полужидкие среды Гисса.

В эти среды добавляют углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу и т.д.) и различные индикаторы. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – регистрируется также появление газообразных продуктов.

3. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями цвет среды в присутствии индикатора Андреде (интервал рН 7,2-6,5) изменяется от соломенно-желтого (первоначальный цвет) до ярко-розового (красного). Если кроме кислоты происходит также образование газа, он скапливается в поплавке. При отсутствии ферментации цвет среды не изменяется.

Поскольку определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван " пестрым рядом ". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Используют короткий и длинный "пестрый ряд". К первому относятся среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и спиртом маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и т.д.), полисахаридами (инулином, крахмалом, гликогеном и т.д.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом).

4. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % МПА, 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды розовато-серый. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, а при наличии и газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, а сам агар разрывается.

Наиболее часто среды Гисса используют для дифференциальной диагностики бактерий кишечно-тифозной группы (для отличия патогенных представителей кишечно-тифозного семейства от нормальных представителей, например E. coli).

5. Для изучения бактерий кишечной группы широкое использование получили дифференциально-диагностические среды, содержащие лактозу – среды Эндо, Левина и Плоскирева. Благодаря наличию у E. coli фермента, расщепляющего лактозу, колонии этого микроба изменяют цвет среды в присутствии того или иного индикатора (на среде Эндо колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет; на среде Левина – в темно-фиолетовый, на среде Плоскирева – в красный). До посева бактерий индикатор фуксин в среде Эндо обесцвечен сульфитом натрия и находится в лейкосоединении. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид. Он взаимодействует с сульфитом натрия, рвется двойная связь, соединяющая его с фуксином, и фуксин восстанавливается.

6. Ферментация лактозы может быть изучена при посеве культуры на молоко: обезжиренное молоко подщелачивают 10 % р-ром карбоната натрия и добавляют в качестве индикатора лакмусовую настойку, разливают по пробиркам и стерилизуют дробным методом. При росте микробов на молоке можно наблюдать подкисление или подщелачивание, свертывание или пептонизацию.

7. Для обнаружения интенсивного кислотообразования, характерного для брожения смешанного типа, используют среду Кларка (1 % глюкоза, 0,5 % пептон, индикатор – метиленовый красный). При рН 4,5 и выше он имеет желтый цвет, при более низких значениях рН – красный цвет.

8. Микроорганизмы, образующие амилазу, способны расщеплять крахмал. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель р-ра Люголя. Если крахмал расщепляется, то цвет среды не изменяется. Если крахмал не расщепляется, среда с этим раствором дает синее окрашивание.

Задача 5. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Протеолитическая активность – это способность микроорганизмов расщеплять белки с образованием различных продуктов (H₂S, NH₃, индола и т.д.). Изучение этих свойств применяется для идентификации бактерий.

2. Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: делают посев изучаемой культуры бактерий уколом в столбик мясопептонного желатина (МПБ + 10-20 % желатина) и оставляют при комнатной температуре (20-22° С) на несколько дней. Через 3-5-10 дней просматривают посевы и отмечают форму разжижения желатина, характерную для различных видов микробов – S. aureus вызывает воронкообразное разжижение; Bac. antracis и синегнойная палочка – послойное разжижение; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижать желатин способны микробы, выделяющие фермент типа коллагеназы;

б) по конечным продуктам распада белков: делают посев на МПБ и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 2-3 дней; для определения продуктов распада белков (индола, аммиака, сероводорода) используют специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ.

Индол обнаруживают по способу Мореля, для чего используют индикаторную бумажку, смоченную насыщенным раствором щавелевой кислоты, которая розовеет при образовании индола. Для обнаружения аммиака используют лакмусовую бумажку, в присутствии которого она синеет. Для обнаружения H₂S используют полоску фильтровальной бумаги, смоченную уксуснокислым свинцом, которая чернеет в присутствии H₂S. Образование H₂S связано с ферментацией серосодержащих аминокислот, чаще всего цистеина. Образование индола и аммиака связано с ферментацией триптофана, под влиянием фермента триптофаназы.

Микроорганизмы, расщепляющие казеин (белок молока), вызывают пептонизацию молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

Задача 6. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ И ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.

Для этого надо знать:

1. Микробные ферменты широко используются в медицине. Из Aspergillus niger получают амилазу и протеазу; из Rhizopus - липазу; из Aspergillus orizae - диастазу, которые применяют для улучшения пищеварения. Из Streptococcus sp. получают стрептокиназу, а из Cl. histolyticum - коллагеназу, которые используют для заживления ран и ожогов.

2. Ферменты микроорганизмов используют в генной инженерии (рестриктазы и лигазы), а также в пищевой промышленности для получения уксусной, молочной и др. кислот, для получения молочнокислых продуктов, в виноделии.

Задача 7. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ.

Для этого надо знать:

1. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом.

2. Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).

3. Три этапа заключаются в следующем:

Первый день. Исследуемый материал (земля, гной) засевают для накопления в среду Китта-Тароцци.

Второй день: а) просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму (в положительном случае обнаруживают помутнение среды и пузырьки газа в ней, а также в мазках – крупные споровые грамположительные палочки); б) для получения изолированных колоний делают посев материала из среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.

Третий день: а) выросшие колонии изучают при помощи лупы и пересевают намеченную колонию в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат; б) проводят исследование чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным признакам.

4. Посев по методу Цейсслера производят следующим образом: каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и растирают шпателем по поверхности среды; затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолированных колоний. Посевы помещают в анаэростат или аппарат Аристовского. На следующий день по форме колоний (при рассматривании через лупу) и микроскопии мазков из них производят ориентировочное определение вида микроорганизмов и пересев отдельных, намеченных колоний на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.

5. Посев по методу Вейнберга производят следующим образом: одну или две капли (петли) материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным (20 мин.) и остуженным до 50°С сахарным МПА, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей водопроводной воды. При этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.

Вместо узких пробирок могут быть использованы трубки Виньяля-Вейона. С их помощью можно произвести посев различных разведений почвенной взвеси для получения изолированных колоний. (Почвенную взвесь готовят следующим образом: к 1 г почвы прибавляют 100 мл стерильной воды в колбе на 250 мл, встряхивают на качалке 15 мин и отстаивают 5 мин; взвесь разбавляют в 10, 100 и 1000 раз, внося последовательно по 1 мл взвеси в пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl.) В пробирки с 10 мл расплавленного и остуженного до 50°С сахарного МПА засевают по 0,1 мл полученных разведений почвенной болтушки (10³, 10⁴, 10⁵),быстро перемешивают и засасывают в стерильные трубки Виньяля-Вейона. Посевы помещают в термостат при 37° С.

6. Посев по методу Перетца производится следующим образом. Вначале готовят разведения исследуемого материала: запаянную пастеровскую пипетку погружают в исследуемый материал (почва, гной и т.д.) и переносят сначала в 3 пробирки с физиологическим раствором (5-10 мл), а затем последовательно в 3 пробирки с расплавленным и охлажденным до 45-50° С агаром по 18-20 мл в каждой. Внеся пипетку в среду, делают ею 1-2 вращательных движения, чтобы смыть посевной материал. Содержимое пробирок быстро перемешивают пастеровской пипеткой и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых кладут стерильные стекла или спички, покрытые стерильными квадратными стеклами (6х6 см). Образуется капиллярная полость, куда быстро затекает расплавленный агар, и где создаются анаэробные условия.

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1. Какие химические реакции протекают в бактериальной клетке?

2. Что такое ферменты?

3. Что представляют собой ферменты по химической природе?

4. Что такое специфичность действия фермента?

5. От чего зависит активность ферментов?

6. Как распределяются ферменты в бактериальной клетке?

7. На какие классы делятся ферменты по типу катализируемой реакции?

8. Какие ферменты называются оксидоредуктазами?

9. Какие ферменты называются трансферазами?

10. Какие ферменты называются гидролазами?

11. Какие ферменты называются изомеразами?

12. Какие ферменты называются лиазами?

13. Какие ферменты называются лигазами?

14. Что такое экзоферменты?

15. Что такое эндоферменты?

16. Какие функции выполняют экзоферменты?

17. Для чего служат ферменты агрессии?

18. Приведите примеры ферментов агрессии?

19. Почему ферменты агрессии являются фактором вирулентности патогенных бактерий?

20. Какой фермент агрессии способствует распространению микроорганизмов в тканях?

21. Какие ферменты бактерий называются конститутивными?

22. Какие ферменты бактерий называются индуцибельными?

23. Какие бактериальные ферменты используются в медицине?

24. Почему определение ферментного состава бактерий является важным для их идентификации?

25. Какие ферментативные свойства изучаются чаще всего для идентификации бактерий?

26. Какие ферментативные свойства изучаются дополнительно для идентификации бактерий?

27. Почему бактерии обладают различными биохимическими свойствами?

28. Назовите ферменты оксидоредуктазы, которые используются для идентификации бактерий?

29. Каким образом определяют наличие каталазы у бактерий?

30. Каким образом определяют наличие цитохромоксидазы у бактерий?

31. Что такое сахаролитические свойства?

32. Для чего изучают сахаролитические свойства бактерий?

33. Какие среды используются для изучения сахаролитических свойств бактерий?

34. Какие конечные продукты образуются при ферментации углеводов бактериями?

35. Опишите состав жидких сред Гисса.

36. Какой индикатор добавляется в жидкие среды Гисса?

37. Как и почему изменяется цвет индикатора в жидких средах Гисса?

38. Что наблюдается, если микроорганизм ферментирует углеводы в средах Гисса до образования кислоты?

39. Что наблюдается, если микроорганизм ферментирует углеводы в средах Гисса до образования кислоты и газа?

40. Какие сахара добавляют в среды Гисса при использовании короткого ряда?

41. Какие сахара добавляют в среды Гисса при использовании длинного ряда?

42. Опишите механизм работы сред Гисса.

43. Почему набор сред Гисса с углеводами получил название "пестрого ряда"?

44. Какой "пестрый ряд" характерен для E. coli?

45. Опишите состав полужидких сред Гисса.

46. Какой индикатор добавляют в полужидкие среды Гисса?

47. Как и почему изменяется цвет индикатора в полужидких средах Гисса?

48. Перечислите дифференциально-диагностические среды, в состав которых входит лактоза.

49. Опишите механизм работы среды Эндо.

50. Для идентификации каких микроорганизмов чаще всего используются среды Эндо, Левина, Плоскирева?

51. По какому признаку определяется ферментация лактозы на молочных средах?

52. Какая среда используется для изучения интенсивного кислотообразования?

53. Какой индикатор добавляется в среду Кларка, и как изменяется его цвет?

54. По какому признаку можно обнаружить наличие амилазы у бактерий?

55. Что такое протеолитические свойства?

56. Какие среды используют для изучения протеолитических свойств бактерий?

57. Какие конечные продукты образуются при расщеплении белков бактериями?

58. Какой фермент присутствует у бактерий, способных разжижать желатин?

59. Каким образом способность разжижать желатин используется для идентификации бактерий?

60. Как определяют образование индола при расщеплении белков бактериями?

61. Как определяют образование H₂S при расщеплении белков бактериями?

62. Как определяют образование аммиака при расщеплении белков бактериями?

63. Как выявляют способность бактерий расщеплять казеин?

64. Объясните суть методов выделения чистых культур бактерий.

65. Какие условия необходимо создать при выделении чистой культуры анаэробов?

66. В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

67. В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

68. В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры анаэробов?

69. Какие методы посева используются для получения изолированных колоний анаэробов?

70. Как производится посев по методу Цейсслера?

71. Куда помещают чашки Петри после посева по методу Цейсслера?

72. Как производится посев по методу Вейнберга?

73. Как производят посев почвенной взвеси с использованием трубок Виньяля-Вейона?

74. Как производят посев по методу Перетца?

75. По каким свойствам проводят исследование и идентификацию чистой культуры анаэробов?

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 2311 | Нарушение авторских прав