АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Занятие № 1. тема: типы и механизмы питания бактерий. культивирование бактерий. питательные среды. выделение чистой культуры аэробов (I эТАП)

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. В состав бактерий входят такие же химические элементы и соединения, что и в состав других организмов, но в несколько других количественных соотношениях.

2. Химический состав бактерий отличается большей изменчивостью (вариабельностью). Он зависит от возраста, условий питания и других условий окружающей среды. Имея широкий набор ферментов, микроорганизмы могут приспосабливаться к самым различным, в том числе и неблагоприятным условиям существования, и в процессе приспособления изменяется их химический состав.

3. В состав бактериальной клетки входит 80 % воды. 40-80 % сухой массы составляют белки (более 2000 видов), построенные обычно из таких же 20 аминокислот (при этом диаминопимелиновая кислота встречается только у бактерий). Большей частью это сложные белки: нуклеопротеиды, липопротеиды, гликопротеиды.

4. На долю ДНК приходится 10-30 %. ДНК бактерий – одна кольцевая биспиральная молекула. Имеются все 3 вида РНК: иРНК, тРНК и рРНК, причем последняя составляет 80 % всей РНК.

5. Углеводы содержатся в количестве 12-18 %. В состав полисахаридов входят глюкоза, гексозамины, глюкуроновая кислота, галактоза, левулеза.

6. Содержание липидов может варьировать от 1,5 до 40 % в зависимости от вида микроорганизмов (например, Mycobacterium tuberculosis содержит 40 % липидов), от возраста и физиологического состояния. Липиды бактерий представлены свободными жирными кислотами (пальмитиновая, стеариновая, миристиновая, олеиновая), фосфолипидами, глицеридами, восками.

7. Минеральные вещества составляют 2-14 % сухой массы: Р, К, Mg, S, Fe, Ca, I, Zn, Mo, Cu, Mn.

Задача 2. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ФУНКЦИИ ОСНОВНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.

Для этого надо знать:

1. Н₂О – дисперсионная среда для коллоидов и растворитель для кристаллических веществ; обеспечивает тургор, участвует в химических реакциях.

2. Белки участвуют в формировании структурных элементов клетки и в различных процессах; большинство из них – ферменты – биологические катализаторы. Именно белки обусловливают антигенность, иммуногенность, вирулентность и видовую специфичность бактерий.

3. ДНК обеспечивает хранение и передачу генетической информации, а РНК участвует в процессе ее реализации через биосинтез специфических белков.

4. Углеводы выполняют структурную функцию, участвуя в построении клеточной стенки и капсулы, а также обеспечивают энергией процессы клеточного метаболизма, определяют антигенные свойства микробов. Крахмал и гликоген выполняют запасающую функцию.

5. Липиды бактерий участвуют в построении цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, у некоторых видов являются запасными питательными веществами.

6. Минеральные вещества принимают участие в регуляции осмотического давления, рН, в активации ферментов.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ТИПЫ ПИТАНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. В качестве питательных веществ бактерии используют самые разнообразные неорганические и органические соединения, что определяет широту их распространения в природе и огромное разнообразие условий существования.

2. Для синтеза собственных органических соединений бактериям необходимы энергия и такие химические элементы как кислород, водород, углерод, азот. Источниками кислорода и водорода являются вода и кислород воздуха у аэробных микробов.

3. По источнику углерода бактерии делят на:

- автотрофы – источником является СО₂;

- гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения (гексозы, спирты, аминокислоты, органические кислоты, образующиеся при гидролизе полисахаридов, белков, липидов).

По источнику энергии:

- фототрофы – используют энергию солнечного света;

- хемотрофы – используют энергию окислительно-восстановитель-ных реакций неорганических и органических соединений.

По донору Н₂ (е):

- литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н₂О, H₂S);

- органотрофы – донором являются органические соединения (карбоновые кислоты, аминокислоты, глюкоза и т.д.).

По источнику азота:

- аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот N₂ (азотфиксирующие бактерии – р. Azotobacter, р. Rhizobium), аммонийные соли, нитраты, нитриты (денитрифицирующие бактерии);

- аминогетеротрофы – источником являются белки.

4. Тот или иной тип питания определяется набором ферментов у данной бактериальной клетки, который в свою очередь определяется специфическими генами в геноме (набор ферментов – видовой признак).

5. Разнообразие типов питания у бактерий определяет их огромное значение в осуществлении круговорота различных элементов в природе.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ПОЛУЧЕНИЕ ЭНЕРГИИ У ФОТОАВТОТРОФОВ, ХЕМОАВТОТРОФОВ, ХЕМО(ОРГАНО)ГЕТЕ-РОТРОФОВ.

Для этого надо знать:

1. Фотоавтотрофы или фотосинтетики – это фотосинтезирующие зеленые и пурпурные серные бактерии, использующие энергию солнечного света для синтеза органических соединений; в качестве источника углерода используют СО₂, а в качестве донора Н₂ (е) – Н₂О, H₂S, карбоновые кислоты.

2. Хемоавтотрофы или хемосинтетики синтезируют органические вещества из СО₂ за счет энергии реакций окисления неорганических соединений. К ним относятся нитрифицирующие бактерии (NH₃ ® HNO₃), серобактерии (H₂S ® S; H₂SO₄), железобактерии (Fe²⁺ ® Fe³⁺), они имеют большое значение в круговороте веществ, переводя такие элементы как азот, сера, железо в более доступную форму, в которой они усваиваются растениями.

3. Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода. К ним относится большинство бактерий:

а) сапрофиты, использующие органические вещества отмерших организмов, не нанося им вреда (бактерии брожения и бактерии гниения);

б) симбионты, использующие органические вещества других живых организмов, не нанося им вреда (образуют симбиоз);

в) паразиты, использующие органические вещества живых организмов; при этом организм хозяина обеспечивает паразита пищей и убежищем. Паразит, как правило, наносит вред, вызывая различные заболевания (патогенные бактерии). Паразиты бывают облигатные (способны жить и расти только внутри живой клетки) и факультативные (после гибели хозяина питаются сапрофитно).

Задача 5. ДАТЬ ПОНЯТИЯ ПРОТО- И АУКСОТРОФНОСТИ.

Для этого надо знать:

1. Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы (как источника углерода) и солей аммония (как источника азота) являются прототрофами.

2. Если же они не способны синтезировать какое-либо соединение, то являются ауксотрофами (многие патогенные бактерии и бактерии нормальной микрофлоры кишечника человека).

3. Для нормального роста и размножения те вещества, которые микроорганизмы не способны синтезировать, они должны получать в готовом виде из окружающей среды. Эти вещества называются факторами роста.

4. К факторам роста относятся аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, нуклеозиды, нуклеотиды, липиды, инозит, холин, витамины В₅, В₂, В₁, В₃, В₆, биотин, фолиевая кислота, парааминобензойная кислота (ПАБК), гем.

5. Потребность в тех или иных факторах роста является видовым признаком, что может быть использовано для идентификации бактерий (например, Mycobacterium tuberculosis нуждается в геме, как в факторе роста; Corynebacterium diphteria – в витамине В₅).

Задача 6. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕНОСА ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В БАКТЕРИАЛЬНУЮ КЛЕТКУ.

Для этого надо знать:

1. Особенностью питания бактерий является поглощение веществ из среды всей поверхностью тела.

2. Питательные вещества могут проникнуть в клетку в виде относительно небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и т.д. предварительно гидролизуются экзоферментами бактерий до аминокислот, моносахаридов, глицерина и жирных кислот, а затем поступают в бактериальную клетку.

3. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы (до 600), Н₂О, ионы. Цитоплазматическая мембрана обладает избирательной проницаемостью, поэтому она является основным регулятором поступления веществ в клетку.

4. Скорость поступления веществ зависит от величины и растворимости молекул в липидах и в воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран.

5. Существует несколько механизмов транспорта:

а) простая диффузия – осуществляется по градиенту концентрации веществ без затраты энергии; решающее значение при этом имеют размеры молекул и их растворимость в липидах;

б) облегченная диффузия – происходит при большей концентрации веществ вне клетки при участии пермеаз;

в) активный транспорт – осуществляется против градиента концентрации с затратой энергии при помощи транспортных белков;

г) транслокация химических групп – в процессе переноса через мембрану молекула вещества химически изменяется, т.к. в исходном виде эти вещества не проходят через мембрану (например, фосфорилирование глюкозы).

Задача 7. ОПИСАТЬ УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Для изучения разнообразных свойств микроорганизмов в лабораторных условиях их искусственно выращивают, т.е. культивируют.

2. При культивировании микробам должна быть обеспечена возможность расти, размножаться и проявлять свою жизнедеятельность. Для этого необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О₂) или создание бескислородных условий.

3. Состав и свойства питательных сред должны соответствовать биологическим свойствам тех микроорганизмов, для выращивания которых они предназначены.

В качестве источника азота используются минеральные и органические соединения; для патогенных бактерий используют такие источники органических соединений, как мясо, рыба, плацента, кровь, дрожжи, кукуруза, ячмень. Так как все эти вещества должны быть в легко усвояемом для микробов виде, белки подвергают частичному расщеплению (протеолизу) и получают пептоны – смесь полипептидов и аминокислот.

В качестве источника углерода используют углеводы, спирты, органические кислоты.

Требования к питательным средам:

а) среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли (натрия, калия и т.д.), факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов;

б) среды должны иметь определенное значение рН (отрицательный lg [Н⁺]); для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4; исключение: холерный вибрион (рН 8,0-8,6), туберкулезная палочка (рН 6,2-6,8); сапрофиты растут в условиях с более широким диапазоном рН – от 2 до 8,5;

в) среды должны обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы рН среды при выращивании микроорганизмов не изменялось;

г) среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl;

д) среды должны быть стерильными для обеспечения возможности получения чистой культуры;

е) среды должные содержать достаточное количество доступнойН₂О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии; (за этим особенно необходимо следить при культивировании на плотных средах; чтобы избежать высыхания, разливать среды в чашки Петри или скашивать в пробирках следует в день посева; при культивировании микробов, особенно чувствительных к отсутствию влаги (например, гонококка) в термостат ставят открытый сосуд с водой);

ж) среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом rH₂; для аэробов rH₂ – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами;

и) среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота (т.е. суммарного азота NH₂-групп аминокислот и низших полипептидов) –0,8-1,2 г/л; содержание общего азота – 2,5-3,0 г/л; содержание хлоридов в пересчете на NaCl – 0,5 %; пептона – 1%.

4. Условия культивирования:

а) температура: для холодолюбивых (психрофильных) микробов – 6-20° С; для средних (мезофильных) – 34-37° С; для теплолюбивых (термофильных) – более 37° С (до 70-75° С);

б) аэрация для аэробов; доступ О₂ обеспечивается путем пассивной и активной аэрации.

При пассивной аэрации микробы потребляют О₂, растворенный в среде, а также находящийся над средой и поступающий в пробирку через ватно-марлевую пробку; при этом культивирование осуществляют на поверхности или в тонком слое среды, куда проникает О₂ воздуха, на плотных или жидких средах в сосудах, закрытых ватно-марлевыми пробками или в чашках Петри.

При активной аэрации производят постоянное перемешивание культуры, что обеспечивает ее соприкосновение с воздухом; применяют при глубинном культивировании, когда микроорганизмы выращивают в больших объемах среды; чтобы обеспечить достаточное снабжение О₂ таких культур, их помещают в специальные качалки; если же объем среды больше 10 и 100 л (в реакторах), то через культуру продувают стерильный воздух;

в) создание бескислородных условий для анаэробов; для этого используются физические, химические и биологические методы, которые будут описаны далее.

5. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают в пробирках, чашках Петри, во флаконах с питательными средами. Время выращивания для большинства составляет 18-24 часа, но могут быть и отклонения, так Mycobacterium tuberculosis выращивают около 3-х недель.

Задача 8. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИЮ И ДАТЬ ХАРАКТЕРИСТИКУ РАЗЛИЧНЫМ ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ.

Для этого надо знать:

1. По консистенции среды делят на:

а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ), сахарный МПБ; применяют для изучения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, для накопления их биомассы или продуктов обмена;

б) полужидкие: мясопептонный агар (МПА) и др.; применяют обычно для хранения культур;

в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок; применяют для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета микроорганизмов и т.д.;

г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором; применяют для хранения посевного материала и культур – продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности;

д) сухие – гигроскопические порошки с влажностью до 10 %, выпускаемые промышленностью; они могут быть различного назначения (простые, специальные, элективные, дифференциально-диагностические); имеют ряд преимуществ: стандартность, простота хранения и транспортировки, простота приготовления; их хранят в герметически закрытой посуде, в темноте; они должны хорошо растворяться в воде при комнатной температуре.

В качестве уплотнителя сред обычно используют агар (0,5-2 %), реже – желатин (10-15 %) или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при температуре 100° С и уплотняющиеся при 45° С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5 % (0,3-0,7 %), к плотным – 1,5-2 %. Выпускают в виде бесцветных пластинок или порошка.

2. По составу среды делят на:

а) естественные – натуральные продукты животного или растительного происхождения: молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови;

б) искусственные – среды, приготовленные по специальным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях, способных обеспечить азотное, углеродное, минеральное питание; состав их всегда точно известен и постоянен, поэтому они широко используются для изучения метаболизма и генетики бактерий.

3. По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА, питательный агар (ПА), сусло-агар, сусло жидкое, питательный желатин; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; они служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) – используют для выделения и культивирования тех микроорганизмов, которые не могут расти на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ, кровяной МПА, асцитический МПБ, сывороточный агар;

в) элективные (избирательные) – используют для выделения определенного вида из мест естественного обитания и для получения накопительных культур; на этих средах преимущественно растет определенный вид, другие не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

Среды обогащения – используются при незначительном количестве возбудителя в патологическом материале; на этих средах выделяемый вид микроба растет быстрее и интенсивнее других, рост которых подавляется ингибиторами: среда Мюллера, среда Лейфсона. Последняя содержит селенит натрия, который подавляет жизнедеятельность кишечной флоры, не препятствуя размножению шигелл и сальмонелл при посеве испражнений больных дизентерией или брюшным тифом.

г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается таким образом, чтобы четко выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Перечисленные среды широко используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянного обитателя кишечника – кишечной палочки. E. coli способна расщеплять входящую в состав этих сред лактозу, т.к. вырабатывает фермент галактозидазу, в отличие от патогенных представителей семейства. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты (например, ацетальдегид), которые изменяют цвет индикатора, присутствующего в среде.

При росте на среде Эндо E. coli образует красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы (возбудители брюшного тифа и дизентерии) образуют на этих средах бесцветные колонии, т.к. не сбраживают лактозу.

Т.о., на одной и той же дифференциально- диагностической среде отмечается различный характер роста разных видов бактерий из-за различия в ферментативной активности, что позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса служат для выявления различий в сахаролитических свойствах микробов с целью их идентификации. Они состоят из ПВ, 1% какого-либо углевода (глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза), индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный едким натром). Эти среды могут готовиться полужидкими с теми же сахарами, но с индикатором ВР (водный голубой краситель + розоловая кислота). В зависимости от ферментации того или иного углевода определенным видом микроорганизмов изменяется цвет среды с этим углеводом. В результате получается "пестрый ряд", характерный для данного вида бактерий.

В настоящее время дифференциально-диагностические среды выпускаются в виде сухих порошков.

4. Консервирующие среды применяются для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. Они предотвращают отмирание патогенных микроорганизмов и подавляют развитие сапрофитов. К ним относятся глицериновая смесь (2 части 0,85 % NaCl, 1 часть глицерина, 1 часть 15-20 % Na₃PO₄), глицериновый консервант с солями Li, гипертонический раствор NaCl.

5. Особые питательные среды применяются для культивирования патогенных спирохет и простейших. Они содержат нативные белки (сыворотку или кровь), кусочки свежих органов и тканей (почки кролика, мозговая ткань кур); либо применяют синтетические питательные среды с определенным набором аминокислот.

Задача 9. ОПИСАТЬ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.

Для этого надо знать:

1. МПБ готовят на мясной воде. 1 кг мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды (она содержит минеральные соли в необходимом для бактерий количестве) и настаивают 24 часа в прохладном месте. Настой кипятят 1 час, остужают, фильтруют до прозрачности, разливают в бутыли и стерилизуют в автоклаве.

К мясной воде добавляют 1 % пептона, 0,5 % NaCl (для создания изотоничности), устанавливают рН (для большинства рН = 7,2-7,6). Затем кипятят 30 мин, добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, фильтруют, еще раз устанавливают рН, разливают по пробиркам и колбам и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

2. МПА готовят на основе МПБ. К МПБ добавляют 1,5-2 % сухого агара, кипятят до его полного растворения, фильтруют в горячем виде, проверяют рН, разливают по пробиркам и колбам и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

Для получения большей поверхности культивирования готовят так называемый косой агар. Для этого пробирки сразу после стерилизации укладывают остывать в наклонном положении. При остывании агар отдает конденсационную воду, собирающуюся внизу пробирки.

3. ПВ – наиболее простая по химическому составу питательная среда. Для приготовления этой среды 1 % пептона и 0,5 % NaCl растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

4. Сложные питательные среды готовят на основе простых. Сахарные среды готовят, добавляя к МПБ или МПА 1 % глюкозу. Стерилизуют в аппарате Коха при 100° С дробным методом.

Сывороточные среды готовят, добавляя к МПБ или МПА 10-20 % стерильной сыворотки (бычьей, лошадиной и др.). МПА предварительно расплавляют на кипящей водяной бане, а затем остужают до 45-50° С и добавляют сыворотку. Сывороточные среды нельзя подвергать стерилизации, и необходимо контролировать их стерильность (ставят в термостат на 3 дня).

Для приготовления кровяного агара стерильно взятую дефибринированную кровь (кролика, барана и др.) прибавляют к стерильному расплавленному и остуженному до 45° С МПА в количестве 5-20 %, тщательно перемешивают, избегая образования пузырьков, разливают в стерильные чашки Петри или пробирки. Среду также нельзя подвергать стерилизации.

5. Приготовление других сред осуществляется по специальным рецептам. Дифференциально-диагностические среды из сухих порошков готовят следующим образом: навеску среды растворяют в дистиллированной воде и после 5-минутного кипячения разливают в стерильные чашки Петри.

6. Для контроля стерильности среды помещают в термостат при 37° С на 5 суток. Жидкие среды должны быть прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста.

Проводят также химический контроль сред (проверяют рН, содержание общего и аминного азота, хлоридов) и биологический контроль (изучают рост лабораторной культуры того микроорганизма, для которого приготовлена среда). Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Задача 10. ДАТЬ ПОНЯТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ, КОЛОНИИ, КЛОНА, ШТАММА.

Для этого надо знать:

1. Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.

2. При размножении бактерий на плотной питательной среде можно наблюдать образование колоний. Колония – это макроскопическое скопление бактериальных клеток, которые являются потомством одной бактериальной клетки. Следовательно, все клетки, входящие в состав одной колонии, принадлежат к одному виду. Колонии различаются по размеру, форме, строению, консистенции и цвету. Внешний вид колоний характерен для определенного вида бактерий.

3. В микробиологии широко применяются термины "штамм" и "клон". Штаммы – это разные микробные культуры одного вида, выделенные из различных источников или даже из одного и того же источника, но в разное время. Штаммы одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по отдельным признакам (устойчивость к антибиотику, ферментация какого-либо сахара и т.д.). Если возбудитель выделен из воды, говорят о водном штамме; из испражнений – фекальном штамме. Вирус гриппа, выделенный в Гонконге, получил название "штамм Гонконг", а в Сингапуре – "штамм Сингапур". Часто штаммы обозначают протокольными номерами.

4. В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуру заведомо из одной клетки. Такая культура называется клоном. Для ее получения пользуются микроманипулятором. Это прибор, снабженный инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат "висячая капля" и нужную клетку (одну!) переносят в питательную среду. Она размножается и образует клон генетически идентичных клеток.

Задача 11. ОПИСАТЬ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ.

Для этого надо знать:

1. Выделение чистой культуры является основой бактериологической работы, т.к. в практической деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов (гной, испражнения и т.д.), идентификация же вида возможна только тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

2. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основные группы методов выделения чистых культур: а) методы, основанные на механическом разделении; б) методы основанные на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

3. Чаще всего используются механические способы разъединения бактериальных клеток – специальные методы посева:

а) рассев шпателем по Дригальскому: берут три чашки Петри с питательным агаром; на первую чашку наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара; затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды; аналогичным образом производят посев шпателем и в третьей чашке. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний; на третьей – минимальное, где вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры;

б) рассев петлей ("штрихами" или "сеткой"): берут одну чашку Петри с питательным агаром; петлей на небольшом участке питательного агара делают сплошной посев исследуемого материала, а затем, отступив от засеянной площадки, делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

в) фильтрация: исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (в основном применяется для очистки вирусов от бактерий).

Т.о., при помощи специальных методов посева добиваются роста микроорганизмов на плотных питательных средах в виде изолированных колоний различных видов бактерий, содержащихся в исходном материале в виде смеси, т.е. получают чистую культуру из одной клетки, а далее осуществляют ее пересев.

4. Биологические способы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов:

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, подвижные формы микробов при размножении как бы "вползают" на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris), отсевая верхние края культуры в воду свежескошенного агара, и, повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру;

б) метод прогревания – прогревают материал при 80° С на водяной бане 10-15 минут, при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают (этот метод позволяет отделить споровые формы от неспоровых);

в) бактериостатический метод – при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на другие (например, пенициллин задерживает рост грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные; 5 % р-р H₂SO₄ убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает);

г) метод обогащения – посев на элективные питательные среды;

д) метод заражения лабораторных животных или растений – заражают исследуемым материалом восприимчивые к возбудителю виды животных или растений; после появления признаков заболевания производят посев органов и тканей на питательные среды (применяют для выделения патогенных видов микроорганизмов и отделения их от сапрофитов).

5. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток (для выращивания микобактерий туберкулеза – 4-6 недель). Процесс выделения чистой культуры можно разделить на три этапа: а) отделение чистой культуры; б) накопление чистой культуры; в) идентификация – заключение о видовой принадлежности.

6. Первый этап (1-ый день):

а) из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют;

б) производят посев исследуемого материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37° С на 24-48 часов (на этом этапе можно использовать и какой-либо биологический способ).

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают результаты посева и проводят описание колоний разных видов по следующим признакам: размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция;

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальных свойств; убеждаются в том, что колония содержит один вид бактерий;

в) осуществляют пересев одной или нескольких различных изолированных колоний в отдельные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37° С 24 часа.

Третий этап (3-ий день):

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют; при наличии чистой культуры обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки (исключение – полиморфные организмы);

в) производят посев на жидкие и полужидкие среды Гисса и МПБ для изучения биохимических (сахаролитических и протеолитических) свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа;

г) проводят идентификацию выделенной чистой культуры по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и др. свойствам; делают окончательный вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры.

Морфологические признаки – форма, расположение и размеры бактериальных клеток.

Тинкториальные признаки – отношение к различным красителям. Эти признаки изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами (например, по Граму) и нативных препаратов.

Культуральные признаки – морфологические особенности колоний и характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Биохимические признаки – способность ферментировать белки, углеводы и другие соединения с образованием различных продуктов (определяются набором ферментов).

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если это является достаточным для их идентификации.

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, восстановление нитратов, декарбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов, а также определение антигенной структуры, чувствительности к фагам, вирулентности и т.д. Для этого проводят дополнительные исследования по определению соответствующего маркера (фермента, антигена, чувствительности к фагам).

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1. Чем отличается химический состав бактерий от других организмов?

2. Почему химический состав бактерий отличается изменчивостью?

3. Какие факторы влияют на химический состав бактерий?

4. Каково количественное содержание различных веществ в бактериальной клетке?

5. Какие функции выполняют белки в бактериальной клетке?

6. Какие функции выполняют ДНК и РНК в бактериальной клетке?

7. Какие функции выполняют углеводы в бактериальной клетке?

8. Какие функции выполняют липиды в бактериальной клетке?

9. Какие функции выполняют вода и минеральные соли в бактериальной клетке?

10. Чем объясняется разнообразие типов питания у бактерий?

11. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику углерода для синтеза органических соединений?

12. Какие бактерии называются автотрофами?

13. Какие бактерии называются гетеротрофами?

14. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику энергии для синтеза органических соединений?

15. Какие бактерии называются фототрофами?

16. Какие бактерии называются хемотрофами?

17. Какие типы питания выделяют у бактерий по донору Н₂ (е) для синтеза АТФ?

18. Какие бактерии называются литотрофами?

19. Какие бактерии называются органотрофами?

20. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику азота для синтеза органических соединений?

21. Какие бактерии называются аминоавтотрофами?

22. Какие бактерии называются аминогетеротрофами?

23. Какие бактерии называются фотоавтотрофами?

24. Какие бактерии называются хемоавтотрофами?

25. Какие химические реакции являются источником энергии у нитрифицирующих бактерий?

26. Какие химические реакции являются источником энергии у серобактерий?

27. Какие химические реакции являются источником энергии у железобактерий?

28. Какие бактерии называются хемо(органо)гетеротрофами?

29. Какие химические соединения используют для питания сапрофиты и паразиты?

30. Какие вещества называются факторами роста? Перечислите эти соединения.

31. Как называются бактерии, нуждающиеся в факторах роста?

32. Какие бактерии называются прототрофами?

33. Каким образом бактерии поглощают вещества из окружающей среды?

34. Какие вещества пропускает клеточная стенка бактерий?

35. Почему мембрана бактериальной клетки является основным регулятором поступления веществ в клетку и из клетки?

36. От чего зависит скорость поступления веществ в бактериальную клетку?

37. Перечислите механизмы транспорта веществ через цитоплазматическую мембрану?

38. Что такое простая диффузия?

39. Что такое облегченная диффузия?

40. Что такое активный транспорт?

41. Какой вид транспорта называется транслокацией химических групп?

42. Для чего используется культивирование бактерий?

43. Какие условия необходимы для культивирования бактерий?

44. На основе чего разрабатывается состав питательных сред?

45. Какие вещества должны содержать питательные среды?

46. Какими физико-химическими свойствами должны обладать питательные среды?

47. Почему питательные среды должны быть изотоничными?

48. Почему питательные среды должны быть стерильными?

49. Почему питательные среды должны обладать буферными свойствами?

50. Какая температура необходима для выращивания различных микроорганизмов?

51. Как делятся среды по составу?

52. Какие среды называются естественными?

53. Какие среды называются искусственными?

54. Какие среды называются синтетическими?

55. Как делятся среды по консистенции? Приведите примеры жидких сред.

56. Как делятся среды по консистенции? Приведите примеры полужидких и плотных сред.

57. Какие вещества используются для уплотнения питательных сред?

58. Какими свойствами обладает агар-агар, и для чего он используется?

59. Для чего используются простые питательные среды? Приведите примеры этих сред.

60. Для чего используются специальные питательные среды? Приведите примеры этих сред.

61. Для чего используются дифференциально-диагностические питательные среды? Приведите примеры этих сред.

62. Какое ферментативное свойство бактерий позволяют выявить среды Эндо, Плоскирева и Левина?

63. Почему колонии E. coli при выращивании на среде Эндо имеют красный цвет?

64. Назовите состав сред Эндо, Плоскирева и Левина.

65. Назовите состав жидких и полужидких сред Гисса.

66. Какие ферментативные свойства бактерий изучаются на средах Гисса?

67. Что такое чистая культура?

68. Почему выделение чистой культуры является основой бактериологической работы?

69. Какие существуют методы выделения чистой культуры?

70. На чем основаны биологические методы выделения чистой культуры?

71. На чем основаны механические методы выделения чистой культуры?

72. В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

73. В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

74. В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры аэробов?

75. По каким признакам проводится идентификация чистой культуры?

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1574 | Нарушение авторских прав