АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Занятие № 2. рост, размножение и дыхание бактерий. пигменты бактерий. выделение чистой культуры аэробов (II этап). принципы культивирования анаэробов

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕХАНИЗМ И СКОРОСТЬ РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Размножение – увеличение числа особей. Бактерии размножаются путем: а) деления клетки пополам (бинарного деления); б) почкования; в) фрагментации нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты).

2. Механизм бинарного деления заключается в следующем: перед делением происходит репликация ДНК с участием ферментов – ДНК-полимераз. Затем образовавшиеся две молекулы ДНК расходятся за счет увеличения размеров растущей клетки, и наступает деление самой клетки. При этом у грамотрицательных бактерий деление клетки осуществляется за счет образования перетяжки, а у грамположительных – перегородки при участии мезосом.

Клетки после деления расходятся в результате аутолиза – расщепления сердцевины перегородки под действием ферментов. Если аутолиз протекает неравномерно, то клетки остаются частично связанными и расходятся не полностью. Они могут располагаться под углом друг к другу, как у дифтерийной палочки.

После некоторого числа генераций клетки стареют и погибают.

3. Скорость размножения различна у разных видов бактерий, чаще – очень высокая (в 100 раз выше, чем у клеток культуры тканей млекопитающих); у E. coli при благоприятных условиях время генерации составляет 20 мин., у Clostridium perfringens и Streptococcus faecalis – 15 мин., а у Mycobacterium tuberculosis – 14-15 час. Скорость размножения ограничена рядом факторов и зависит от характера среды, возраста, температуры, аэрации, наличия питательных веществ и накопления продуктов обмена.

Задача 2. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОСОБЕННОСТИ РОСТА И РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ В ЖИДКИХ И НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.

Для этого надо знать:

1. Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Такое культивирование называется периодическим, а культура – периодической. Если производить непрерывную подачу свежей питательной среды и отток такого же объема культуральной жидкости, то такая культура называется непрерывной.

2. Рост и размножение периодической культуры в жидкой питательной среде имеет несколько фаз, что можно изобразить в виде кривой зависимости логарифма числа клеток от времени.

I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения (4-5 часов); происходит адаптация к условиям размножения и увеличение размеров клеток.

II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий (5-6 часов); клетки делятся с постоянной скоростью, и логарифм числа клеток линейно зависит от времени; в этот период бактерии обладают высокой химической и биологической активностью, но слабой резистентностью.

III фаза – фаза стационарного роста – период равновесия межу делящимися, находящимися в покое и отмершими клетками; количество живых клеток остается без изменения и составляет максимальный уровень в единице объема (М-концентрация); продолжительность этой фазы выражается в часах и зависит от вида бактерий, особенностей культивирования; М-концентрация также зависит от вида бактерий и условий среды.

IV фаза – фаза гибели – период логарифмического снижения количества живых клеток (от 10 часов до нескольких недель); происходит отмирание клеток с постоянной скоростью.

V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – период, когда оставшиеся в живых клетки переходят в состояние покоя.

3. Характер роста бактерий в жидких питательных средах может быть следующим: а) поверхностным – образование пленки (возбудители холеры и туберкулеза, сенная палочка); б) диффузным – равномерное помутнение среды (представители сем. Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus); в) придонным – образование осадка (Bacillus anthracis).

4. При росте бактерий на плотной питательной среде образуются колонии. Колонии – это макроскопические скопления микробов одного вида, образовавшиеся из одной клетки. Колонии бывают разными по размеру, форме, цвету, поверхности, форме края, консистенции, структуре.

5. По размеру колонии бывают: а) крупные – d > 5 мм; б) средние – d = 2-4 мм; в) мелкие – d = 1-2 мм; г) карликовые (точечные) – d < 1 мм.

Форма бывает правильная круглая, неправильная, ризоидная, розеткообразная, звездчатая, древовидная и т.д.

Колонии могут быть бесцветными или имеют определенный цвет (белый, желтый, оранжевый, красный, золотистый, розовый), что определяется пигментами бактерий.

Поверхность может быть гладкая, морщинистая, блестящая, складчатая, сухая, влажная, слизистая, шероховатая, исчерченная, бугристая, выпуклая или плоская.

Края – ровные, фестончатые, зазубренные, волнистые, бахромчатые (их лучше изучать под микроскопом с малым увеличением).

Консистенция – слизистая (колония прилипает к петле), волокнистая (снимается вся колония), мягкая, плотная, врастающая в агар, хрупкая (разрушается при прикосновении петли).

Структура – прозрачная, непрозрачная, зернистая, однородная (гомогенная) или различная в центре и по периферии (гетерогенная). Структуру лучше изучать с помощью стереоскопического микроскопа или под лупой.

6. Внешний вид колонии характерен для определенного вида бактерий и может изменяться в зависимости от условий. Колонии, имеющие ровные края и гладкую поверхность – колонии S-формы, а колонии с неровными краями и шероховатой поверхностью – колонии R-формы. Внешний вид колоний у некоторых бактерий очень характерен и является дифференциальным признаком. Например, колонии возбудителя чумы имеют вид смятого кружевного платочка; микоплазмы образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ МИКРОБАМИ ПИГМЕНТОВ И ДРУГИХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ.

Для этого надо знать:

1. Некоторые микроорганизмы (бактерии и грибы почвы, воды и воздуха) вырабатывают пигменты – красящие вещества, которые участвуют в дыхании, как переносчики Н₂, защищают от ультрафиолетовых лучей, участвуют в реакциях синтеза, оказывают антибиотическое действие. При выращивании этих микроорганизмов жидкая среда или колонии, образующиеся на плотных средах, окрашиваются в определенный цвет. Красный цвет имеют колонии Serratia marcescens; розовый – розовый микрококк; золотистый – S. aureus; синий – Pseudomonas aeruginosa, фиолетовый – хромобактер фиолетовый; желтый или оранжевый – микобактерии туберкулеза.

2. В морской воде (чаще всего) встречаются светящиеся бактерии. У этих микроорганизмов энергия окислительно-восстановительных реакций превращается в люминесценцию (Photobacterium phosphoreum).

3. Некоторые бактерии обладают способностью синтезировать витамины, аминокислоты, антибиотики, летучие и ароматические вещества.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ АЭРОБНЫЙ И АНАЭРОБНЫЙ ТИПЫ ДЫХАНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Дыхание (биологическое окисление) – совокупность окислительно-восстановительных реакций, идущих с образованием АТФ. Окисление – отдача водорода или электронов донорами. Восстановление – присоединение водорода или электронов акцепторами. Донорами являются сахара, спирты, органические кислоты, жиры, аминокислоты и др. Эти вещества называются субстратами дыхания. Акцепторами водорода могут быть кислород и другие вещества.

2. При аэробном типе дыхания акцептором водорода является кислород. Микроорганизмы с таким типом дыхания являются аэробами.

При анаэробном типе дыхания акцептором водорода являются другие соединения. Микроорганизмы с этим типом дыхания называются анаэробами.

3. Если в окислительно-восстановительных реакциях и донорами и акцепторами являются органические соединения (т.е. происходит неполное окисление), то такой процесс называется брожением. Он протекает в анаэробных условиях.

При брожении чаще всего происходит расщепление глюкозы и других углеводов, но могут быть использованы также аминокислоты, жирные кислоты.

По конечному продукту различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожения. Молочнокислое брожение характерно для родов Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, маслянокислое – для рода Clostridium, пропионовокислое – для рода Propionibacterium. Спиртовое брожение осуществляется дрожжами (микроскопические грибы). Образование кислот в результате брожения в среде можно определить при помощи индикатора.

4. К анаэробам относятся:

а) облигатные анаэробы – клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка; они растут только в бескислородных условиях, кислород для них токсичен, т.к. отсутствуют ферменты каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза, которые инактивируют токсичные формы кислорода и имеются у аэробных бактерий; для облигатных анаэробов характерно сульфатноедыхание, при котором акцептором водорода являются сульфаты, восстанавливающиеся до H₂S;

б) факультативные анаэробы – большинство патогенных и сапрофитных бактерий (E. coli и др.); они растут как при наличии, так и при отсутствии кислорода; для них характерно нитратное дыхание, при котором акцептором водорода являются нитраты, восстанавливающиеся до N₂ и NH₃. Среди них имеются аэротолерантные формы, которые растут при наличии кислорода, но ни используют его.

5. Облигатные аэробы могут расти только при наличии достаточного количества кислорода в среде. К ним относятся бруцеллы, микрококки, микобактерии туберкулеза (для роста необходимо около 20 % кислорода).

6. Между аэробным и анаэробным типами дыхания нет резкой границы. При отсутствии кислорода дрожжи, например, способны расщеплять глюкозу до спирта и СО₂, а при аэрации глюкоза ими расщепляется до СО₂ и Н₂О (происходит полное окисление глюкозы). При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление.

С₆Н₁₂О₆ ® 2 С₂Н₅ОН + 2СО₂ + 31, 2 ккал

С₆Н₁₂О₆ + 6 О₂ ® 6СО₂ + 6Н₂О + 688,5 ккал

Способностью переключаться с анаэробного дыхания на аэробное обладают и бактерии - факультативные анаэробы.

Задача 5. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ БЕСКИСЛОРОДНЫХ УСЛОВИЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ.

Для этого надо знать:

1. Для культивирования анаэробов необходимо создать условия анаэробиоза – пониженного содержания кислорода в среде и окружающем пространстве. Для этого используются физические, химические и биологические методы.

2. Физические методы основаны на физических и механических способах и приемах создания бескислородных условий. Для этого:

а) осуществляют посев в глубинуплотных питательных сред (кровяной или сахарный агар): посев уколом в высокий столбик агара (анаэробы вырастают в глубине посева); посев в глубину агара в пробирках или трубках Виньяля-Вейона: берут стеклянную трубку (длиной 30 см, d = 3-6 мм), один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого делают перетяжку и вставляют ватную пробку; исследуемый материал засевают в пробирки с расплавленным и охлажденным агаром, а затем засеянный агар насасывают в стерильные трубки Виньяля-Вейона; капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки, и трубки помещают в термостат;

б) выращивают анаэробные бактерии в специальных средах, содержащих редуцирующие вещества – глюкозу, муравьинокислый натрий, а также кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печени, селезенки, мозга, картофеля и др.).

Универсальной средой является среда Китта-Тароцци - это жидкая питательная среда, состоящая из сахарного бульона (0,5 % глюкозы) и кусочков животных тканей (например, печени, обладающей высокой способностью связывать кислород). Перед посевом из среды удаляют кислород путем кипячения в течение 10-30 минут и быстро охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. Эта среда используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры.

в) выращивают анаэробные микроорганизмы в сосудах, из которых удаляют воздух или заменяют его индифферентным газом (азотом, водородом, СО₂); такими сосудами могут быть анаэростат или эксикатор, куда помещают посевы на чашках Петри с кровяным или сахарным агаром.

Анаэростат – толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой с резиновой прокладкой, снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения в анаэростате засеянных чашек Петри (крышкой вверх) из него удаляют воздух при помощи масляного насоса или вытесняют его газом из баллона (или аппарата Киппа).

3. Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (аппарате Аристовского) химическими веществами (такими как щелочной пирогаллол или гидросульфит натрия).

4. Биологические методы (метод Фортнера) основаны на совместном культивировании анаэробов с аэробами (S. aureus, S. marcescens). Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной 1см, получается два агаровых полудиска в одной чашке. На один из них засевают аэроб, а на другой – анаэроб. После посева чашки Петри герметически закрывают, используя пластилин или парафин (среду в чашки Петри наливают толстым слоем для сокращения воздушного пространства). Вначале в чашке Петри размножаются аэробы, а когда весь кислород в пространстве чашки будет использован, начинается рост анаэробов.

Различные метод создания анаэробиоза могут комбинироваться.

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1. Что такое размножение? Перечислите способы размножения бактерий.

2. Какой способ размножения наиболее распространен у бактерий?

3. Как происходит деление клетки у грамотрицательных и грамположительных бактерий?

4. Что такое аутолиз?

5. Почему у дифтерийной палочки клетки располагаются под углом друг к другу?

6. С какой скоростью размножаются разные виды бактерий?

7. От чего зависит скорость размножения бактерий?

8. Каков характер роста бактерий в жидкой питательной среде?

9. У каких микроорганизмов наблюдается поверхностный рост в жидкой среде?

10. У каких микроорганизмов наблюдается диффузный рост в жидкой среде?

11. У каких микроорганизмов наблюдается придонный рост в жидкой среде?

12. Почему прекращается рост у бактерий, если не обновлять питательную среду?

13. Что такое периодическая культура?

14. Что такое непрерывная культура?

15. Перечислите фазы роста периодической культуры в жидкой питательной среде.

16. Что такое лаг-фаза?

17. Что происходит во время логарифмической фазы роста?

18. Охарактеризуйте фазу стационарного роста.

19. Какие процессы развиваются после фазы стационарного роста?

20. Между какими клетками наблюдается равновесие в фазе стационарного роста?

21. Что такое М-концентрация, и от чего она зависит?

22. В какой фазе роста бактерии наиболее чувствительны к действию различных факторов?

23. В какой фазе роста бактериальные клетки переходят в состояние покоя?

24. Что показывает М-концентрация?

25. Каков характер роста бактерий на плотных питательных средах?

26. Что такое колония?

27. Перечислите признаки, по которым производится описание колоний?

28. Для каких бактерий внешний вид колоний является важным дифференциально-диагностическим признаком?

29. Как различаются колонии по размеру и форме?

30. Как различаются колонии по цвету и характеру поверхности?

31. Как различаются колонии по форме края, консистенции и структуре?

32. Чем обусловлена различная окраска колоний?

33. Что такое пигменты, и какие они выполняют функции в микробной клетке?

34. Какие бактерии способны к люминесценции?

35. Приведите примеры различной окраски колоний.

36. Какой внешний вид имеют колонии микоплазм?

37. Что такое дыхание?

38. Какую функцию выполняет АТФ?

39. Что такое окисление и восстановление?

40. Назовите субстраты дыхания.

41. Какие соединения могут быть акцепторами водорода?

42. Что такое анаэробное дыхание?

43. Что такое аэробное дыхание?

44. Как называется процесс, в котором органические вещества являются и донорами, и акцепторами водорода?

45. Что такое брожение?

46. Какие вещества могут сбраживаться микроорганизмами?

47. Какие продукты образуются в результате брожения?

48. Какие вы знаете виды брожения?

49. Что такое молочнокислое брожение? У каких микроорганизмов оно встречается?

50. Что такое маслянокислое брожение? У каких микроорганизмов оно встречается?

51. Какое дыхание является энергетически более выгодным?

52. Почему аэробное дыхание является энергетически более выгодным?

53. Объясните взаимосвязь между аэробным и анаэробным типами дыхания?

54. Какие микроорганизмы называются облигатными анаэробами?

55. Какие микроорганизмы называются факультативными анаэробами?

56. Что такое сульфатное дыхание?

57. Что такое нитратное дыхание?

58. Приведите примеры облигатных и факультативных анаэробов?

59. Что такое аэротолерантность?

60. Какие ферменты защищают бактерии от активных форм кислорода?

61. У каких бактерий отсутствуют каталаза, супероксиддисмутаза и пероксидаза?

62. Какие бактерии называются облигатными аэробами?

63. Какие условия необходимы для культивирования анаэробов?

64. Какие существуют методы создания анаэробных условий?

65. Перечислите физические методы создания бескислородных условий?

66. Какие вещества добавляются в среды для связывания кислорода при выращивании анаэробов?

67. Какая среда используется для выращивания анаэробов?

68. Опишите состав среды Китта-Тароцци.

69. Как осуществляется приготовление среды Китта-Тароцци?

70. Для чего используется среда Китта-Тароцци?

71. Какими способами осуществляется посев в глубину плотных питательных сред?

72. Что такое анаэростат?

73. Каким образом создаются бескислородные условия в анаэростате?

74. В чем суть химических методов создания бескислородных условий?

75. В чем суть метода Фортнера?

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1217 | Нарушение авторских прав