АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы почвенной микробиологии

В микробиологии существует целый ряд методов изучения, культивирования и учета микроорганизмов. Разнообразие методов связано не только с наличием различных экологических групп микроорганизмов, но и с чрезвычайно большим разнообразием способов питания, путей метаболизма представителей микроскопического мира существ, превращения исходных про­дуктов и субстратов, а также со специфическими по­требностями отдельных видов микроорганизмов в оп­ределенных веществах (факторах роста), которых они сами не могут синтезировать.

По способу питания микроорганизмы делятся на:

· гетеротрофов, использующих готовое органичес­кое вещество (их большинство),

· автотрофов, способных самостоятельно синтези­ровать органические вещества из неорганических веществ.

По отношению к молекулярному кислороду мир микроорганизмов делится на:

· аэробов, живущих и размножающихся только в присутствии О₂;

· анаэробов, способных жить в бескислородной среде.

Различаются микроорганизмы и по их отношению к температуре и рН среды.

В зависимости от различного отношения микроор­ганизмов к пище и экологическим факторам для их культивирования приготавливают синтетические питательные среды или используют естественные (молоко, сыворотку крови, картофель, различные соки растений и др.), а также мясопептонный бульон, пивное сусло, вытяжки из почвы, торфа и т. д. Из синтетических сред широко используются определенные наборы хими­ческих веществ, в том числе минеральных для авто­трофов. Среды могут быть жидкими или плотными с добавлением 2 % агар-агара или 20 % желатины.

Аэробов культивируют на стерильной плотной или жидкой питательной среде. В последнем случае используют постоянное аэрирование - продувание стериль­ного воздуха или встряхивание на специальных качал­ках. Среда для анаэробов кипятится и сверху залива­ется не пропускающим воздух маслом или помещается в специальные камеры - анаэростаты с выкаченным воздухом.

Для изучения и количественного учета почвенных микроорганизмов используют лабораторные и полевые методы.

Отбор проб для лабораторных исследований начинается со стерилизации инструментов, при помощи которых берется проба почвы, посуды, в которой эти пробы доставляются в лабораторию, и питательных сред.

Существуют следующие виды стерилизации:

· сухим жаром при температуре 160°С в течение 2 - ­3 часов (ножи, иглы, скальпели и другие инстру­менты, посуда) или прокаливанием в пламени го­релки (иглы, петли, горлышки колб, пробирок и др.);

· автоклавированием в герметически закрываемой камере при 120°С в течение не менее 20 минут го­рячим паром под давлением;

· текучим паром при температуре 100°С однократ­ной обработкой не менее 30 минут или путем дроб­ной стерилизации (повторно через сутки) для того, чтобы убить проросшие споры у спорообразующих бактерий;

· фильтрованием через мембранные фильтры из асбеста с целлюлозой или из эфиров целлюлозы; такие фильтры вставляют в колбы (все, естествен­но, должно быть стерильным) и через них фильт­руют жидкость, содержащую микроорганизмы, которые задерживаются на фильтре, а полученный фильтрат оказывается стерильным;

· облучение ультрафиолетовыми лучами или гамма-лучами.

Для изучения микроорганизмов используют чистые и накопительные культуры. В природных условиях микроорганизмы находятся в сложных сообществах, обычно состоящих из многочисленных популяций раз­ных видов. В таких сообществах изучать физиологические особенности, рост и развитие отдельных видов очень трудно или просто невозможно.

Чистая культура - выращивание одного вида микроорганизма. Такая культура получается в несколь­ко этапов. Делается это в основном двумя методами:

· разведением. При разведении небольшую навеску почвы разводят в сотни тысяч раз стерильной во­дой, а затем небольшое количество полученного фильтрата высевают на плотную среду и из вы­росших колоний выделяют чистые культуры.

· капиллярным. Более точный метод получения чис­той культуры основан на использовании капилляров. В разведенный фильтрат опускают капилляры с плоскопараллельными стенками и под микроско­пом находят то место, где расположена одна мик­робная клетка. Она затем высевается на стериль­ную среду.

В дальнейшем создаются благоприятные для дан­ного вида условия: оптимальная температура, аэрация (или отсутствие О₂ для анаэробов), рН среды и т.д. Принимаются меры для предохранения полученной культуры от заражения другими видами микроорганиз­мов. Культура постоянно проверяется на однородность.

Чистые культуры в почвенной микробиологии ис­пользуются редко, так как по активности микроорга­низма в чистой культуре трудно судить об его активно­сти в природной обстановке поля, леса, луга и т.д., где он находится в тесном взаимодействии и взаимной связи с другими организмами.

Накопительной культурой называют такую куль­туру, в которой резко преобладает один или несколь­ко близких видов микроорганизмов. Она получается путем посева материала с присутствием интересую­щего вида на элективную среду, благоприятную для данного вида или группы видов, и чуждую - для других. Например, берут комочек почвы, в котором, как известно, присутствует множество видов микро­бов, и помещают в среду, не содержащую азота. Есте­ственно, на безазотистой среде могут расти и разви­ваться только такие микроорганизмы, которые способ­ны добывать молекулярный азот из атмосферы, так называемые азотфиксаторы. Через некоторое время другие микроорганизмы погибнут или будут влачить жалкое существование, а азотфиксирующие - про­цветать.

Для количественного и качественного учета мик­роорганизмов почвы в лабораторных условиях используют:

Посевы на плотную питательную среду предусматривают разведение навески почвы дистиллирован­ной стерильной водой обычно в 100 000 раз; из полу­ченной болтушки берется небольшое количество жид­кости (1 мл) и наносится на плотную питательную среду. Через З-7 суток на поверхности среды вырас­тают несколько десятков или сотен колоний. Данный метод дает заниженные результаты, так как питатель­ные среды не могут быть универсальными для всех организмов. Питательную среду в данном случае луч­ше приготавливать на почвенной вытяжке, предвари­тельно простерилизованной.

Метод прямого микроскопирования заключается в непосредственном подсчете под микроскопом числа микроорганизмов в капле почвенной суспензии, пред­варительно нанесенной на чистое стерильное и обез­жиренное предметное стекло, зафиксированной после размазывания над пламенем горелки и окрашенной соответствующим реактивом (карболовым фуксином и др.). При использовании люминесцентного микроскопа мазок с микроорганизмами окрашивается флуорохро­мом акридином оранжевым. Живые микроорганизмы в ультрафиолете светятся зеленым, а мертвые - красным светом. Этот метод наиболее точный.

Из лабораторных методов определения физиологи­ческой активности почвенных микроорганизмов следует назвать учет выделяемой в процессе дыхания или брожения микроорганизмами СО₂, накопления нитратов в среде с аммонийными формами азота (нитрифи­цирующая способность), активности различных фер­ментов, выделяемых микроорганизмами, и некоторые другие. Выделяющаяся при использовании первого метода СО₂ из почвенных образцов, помещенных в гер­метически закрытые колбы, поглощается раствором барита, избыток которого оттитровывается кислотой, обычно соляной. Нитрифицирующую способность оп­ределяют с использованием накопительной культуры со средой С.Н. Виноградского. Стерилизованные колбы со средой засеваются комочками почвы и помещаются в термостат с температурой 25-30°С на 5-6 дней.

Наличие азотной и азотистой кислот определяют одним из количественных или качественных методов. Из последних чаще всего используется метод обнару­жения азотной кислоты с помощью реакции с дефини­ламином в крепкой серной кислоте: синее окрашива­ние при смешивании реактива с каплей жидкости из накопительной культуры будет свидетельствовать о наличии иона NО₃^-. Азотистая кислота обнаруживает­ся с помощью реактива Грисса, с которым она дает красное окрашивание.

Ферментативную активность аэробных целлю­лозоразрушающих микроорганизмов можно опреде­лить несколькими методами. Один из них, самый простой, заключается в следующем. Обогащенную КNО₃ навеску почвы увлажняют и помещают в чаш­ку Петри, на дно которой кладут стерильные обеззо­ленные фильтры. На поверхность почвы, уложенной в виде тонкой пластинки, накладывают фильтроваль­ную бумагу и плотно прижимают ее к поверхности почвенной пластинки. Приготовленные таким обра­зом образцы помещают во влажные камеры на раз­личное время в зависимости от свойств почвы (обыч­но несколько недель и более). По характеру и степени разложения бумаги судят об активности внеклеточных ферментов целлюлозоразрушающих микроорганиз­мов. Подобным образом можно изучать активность других групп микроорганизмов, например пектин­ или лигнинразрушающих.

Непосредственно в природной обстановке, в том числе в лесу, используют полевые методы учета коли­чества или активности микроорганизмов.

Одним из широко распространенных полевых методов является метод стекол обрастания (по Н.Г. Хо­лодному). На стерильные стекла наносят твердую пи­тательную смесь, например крахмало-аммиачный агар, и закапывают их на глубину 3 - 5 см. Через некоторое время на среде появляются колонии характерных для данной почвы микроорганизмов.

Большой интерес представляет метод капиллярных педоскопов Б.В. Перфильева и Д.Р. Габе. Приго­тавливается набор капиллярных ячеек с прямоуголь­ными каналами. Капилляры заполняют полужидкой агаризованной средой с добавлением перегнойных фульвокислот, составных частей гумуса почвы. Приго­товленные таким образом капилляры закапывают в почву на 1,5 - 2 месяца. В капилляры проникают и раз­виваются характерные для того или иного генетичес­кого горизонта почв сообщества микроорганизмы.

Часто микробиологи, занимающиеся изучением почвенных микроорганизмов, используют метод аппликаций, который учитывает микробиологическую ак­тивность почвы и отдельных представителей почвен­ного микромира. Для этого полоски бумаги, состоящие, как известно, из целлюлозы или хлопчатобумажного полотна, закрепляют на стекле и закапывают в почву на определенную глубину на срок до трех месяцев. Микробиологическая активность, в данном случае цел­люлозоразрушающих микроорганизмов, оценивается по скорости разложения целлюлозы (количеству раз­рушенной ткани или бумаги).

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1770 | Нарушение авторских прав