Методы почвенной микробиологии
В микробиологии существует целый ряд методов изучения, культивирования и учета микроорганизмов. Разнообразие методов связано не только с наличием различных экологических групп микроорганизмов, но и с чрезвычайно большим разнообразием способов питания, путей метаболизма представителей микроскопического мира существ, превращения исходных продуктов и субстратов, а также со специфическими потребностями отдельных видов микроорганизмов в определенных веществах (факторах роста), которых они сами не могут синтезировать.
По способу питания микроорганизмы делятся на:
· гетеротрофов, использующих готовое органическое вещество (их большинство),
· автотрофов, способных самостоятельно синтезировать органические вещества из неорганических веществ.
По отношению к молекулярному кислороду мир микроорганизмов делится на:
· аэробов, живущих и размножающихся только в присутствии О2;
· анаэробов, способных жить в бескислородной среде.
Различаются микроорганизмы и по их отношению к температуре и рН среды.
В зависимости от различного отношения микроорганизмов к пище и экологическим факторам для их культивирования приготавливают синтетические питательные среды или используют естественные (молоко, сыворотку крови, картофель, различные соки растений и др.), а также мясопептонный бульон, пивное сусло, вытяжки из почвы, торфа и т. д. Из синтетических сред широко используются определенные наборы химических веществ, в том числе минеральных для автотрофов. Среды могут быть жидкими или плотными с добавлением 2 % агар-агара или 20 % желатины.
Аэробов культивируют на стерильной плотной или жидкой питательной среде. В последнем случае используют постоянное аэрирование - продувание стерильного воздуха или встряхивание на специальных качалках. Среда для анаэробов кипятится и сверху заливается не пропускающим воздух маслом или помещается в специальные камеры - анаэростаты с выкаченным воздухом.
Для изучения и количественного учета почвенных микроорганизмов используют лабораторные и полевые методы.
Отбор проб для лабораторных исследований начинается со стерилизации инструментов, при помощи которых берется проба почвы, посуды, в которой эти пробы доставляются в лабораторию, и питательных сред.
Существуют следующие виды стерилизации:
· сухим жаром при температуре 160°С в течение 2 - 3 часов (ножи, иглы, скальпели и другие инструменты, посуда) или прокаливанием в пламени горелки (иглы, петли, горлышки колб, пробирок и др.);
· автоклавированием в герметически закрываемой камере при 120°С в течение не менее 20 минут горячим паром под давлением;
· текучим паром при температуре 100°С однократной обработкой не менее 30 минут или путем дробной стерилизации (повторно через сутки) для того, чтобы убить проросшие споры у спорообразующих бактерий;
· фильтрованием через мембранные фильтры из асбеста с целлюлозой или из эфиров целлюлозы; такие фильтры вставляют в колбы (все, естественно, должно быть стерильным) и через них фильтруют жидкость, содержащую микроорганизмы, которые задерживаются на фильтре, а полученный фильтрат оказывается стерильным;
· облучение ультрафиолетовыми лучами или гамма-лучами.
Для изучения микроорганизмов используют чистые и накопительные культуры. В природных условиях микроорганизмы находятся в сложных сообществах, обычно состоящих из многочисленных популяций разных видов. В таких сообществах изучать физиологические особенности, рост и развитие отдельных видов очень трудно или просто невозможно.
Чистая культура - выращивание одного вида микроорганизма. Такая культура получается в несколько этапов. Делается это в основном двумя методами:
· разведением. При разведении небольшую навеску почвы разводят в сотни тысяч раз стерильной водой, а затем небольшое количество полученного фильтрата высевают на плотную среду и из выросших колоний выделяют чистые культуры.
· капиллярным. Более точный метод получения чистой культуры основан на использовании капилляров. В разведенный фильтрат опускают капилляры с плоскопараллельными стенками и под микроскопом находят то место, где расположена одна микробная клетка. Она затем высевается на стерильную среду.
В дальнейшем создаются благоприятные для данного вида условия: оптимальная температура, аэрация (или отсутствие О2 для анаэробов), рН среды и т.д. Принимаются меры для предохранения полученной культуры от заражения другими видами микроорганизмов. Культура постоянно проверяется на однородность.
Чистые культуры в почвенной микробиологии используются редко, так как по активности микроорганизма в чистой культуре трудно судить об его активности в природной обстановке поля, леса, луга и т.д., где он находится в тесном взаимодействии и взаимной связи с другими организмами.
Накопительной культурой называют такую культуру, в которой резко преобладает один или несколько близких видов микроорганизмов. Она получается путем посева материала с присутствием интересующего вида на элективную среду, благоприятную для данного вида или группы видов, и чуждую - для других. Например, берут комочек почвы, в котором, как известно, присутствует множество видов микробов, и помещают в среду, не содержащую азота. Естественно, на безазотистой среде могут расти и развиваться только такие микроорганизмы, которые способны добывать молекулярный азот из атмосферы, так называемые азотфиксаторы. Через некоторое время другие микроорганизмы погибнут или будут влачить жалкое существование, а азотфиксирующие - процветать.
Для количественного и качественного учета микроорганизмов почвы в лабораторных условиях используют:
Посевы на плотную питательную среду предусматривают разведение навески почвы дистиллированной стерильной водой обычно в 100 000 раз; из полученной болтушки берется небольшое количество жидкости (1 мл) и наносится на плотную питательную среду. Через З-7 суток на поверхности среды вырастают несколько десятков или сотен колоний. Данный метод дает заниженные результаты, так как питательные среды не могут быть универсальными для всех организмов. Питательную среду в данном случае лучше приготавливать на почвенной вытяжке, предварительно простерилизованной.
Метод прямого микроскопирования заключается в непосредственном подсчете под микроскопом числа микроорганизмов в капле почвенной суспензии, предварительно нанесенной на чистое стерильное и обезжиренное предметное стекло, зафиксированной после размазывания над пламенем горелки и окрашенной соответствующим реактивом (карболовым фуксином и др.). При использовании люминесцентного микроскопа мазок с микроорганизмами окрашивается флуорохромом акридином оранжевым. Живые микроорганизмы в ультрафиолете светятся зеленым, а мертвые - красным светом. Этот метод наиболее точный.
Из лабораторных методов определения физиологической активности почвенных микроорганизмов следует назвать учет выделяемой в процессе дыхания или брожения микроорганизмами СО2, накопления нитратов в среде с аммонийными формами азота (нитрифицирующая способность), активности различных ферментов, выделяемых микроорганизмами, и некоторые другие. Выделяющаяся при использовании первого метода СО2 из почвенных образцов, помещенных в герметически закрытые колбы, поглощается раствором барита, избыток которого оттитровывается кислотой, обычно соляной. Нитрифицирующую способность определяют с использованием накопительной культуры со средой С.Н. Виноградского. Стерилизованные колбы со средой засеваются комочками почвы и помещаются в термостат с температурой 25-30°С на 5-6 дней.
Наличие азотной и азотистой кислот определяют одним из количественных или качественных методов. Из последних чаще всего используется метод обнаружения азотной кислоты с помощью реакции с дефиниламином в крепкой серной кислоте: синее окрашивание при смешивании реактива с каплей жидкости из накопительной культуры будет свидетельствовать о наличии иона NО3-. Азотистая кислота обнаруживается с помощью реактива Грисса, с которым она дает красное окрашивание.
Ферментативную активность аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов можно определить несколькими методами. Один из них, самый простой, заключается в следующем. Обогащенную КNО3 навеску почвы увлажняют и помещают в чашку Петри, на дно которой кладут стерильные обеззоленные фильтры. На поверхность почвы, уложенной в виде тонкой пластинки, накладывают фильтровальную бумагу и плотно прижимают ее к поверхности почвенной пластинки. Приготовленные таким образом образцы помещают во влажные камеры на различное время в зависимости от свойств почвы (обычно несколько недель и более). По характеру и степени разложения бумаги судят об активности внеклеточных ферментов целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Подобным образом можно изучать активность других групп микроорганизмов, например пектин или лигнинразрушающих.
Непосредственно в природной обстановке, в том числе в лесу, используют полевые методы учета количества или активности микроорганизмов.
Одним из широко распространенных полевых методов является метод стекол обрастания (по Н.Г. Холодному). На стерильные стекла наносят твердую питательную смесь, например крахмало-аммиачный агар, и закапывают их на глубину 3 - 5 см. Через некоторое время на среде появляются колонии характерных для данной почвы микроорганизмов.
Большой интерес представляет метод капиллярных педоскопов Б.В. Перфильева и Д.Р. Габе. Приготавливается набор капиллярных ячеек с прямоугольными каналами. Капилляры заполняют полужидкой агаризованной средой с добавлением перегнойных фульвокислот, составных частей гумуса почвы. Приготовленные таким образом капилляры закапывают в почву на 1,5 - 2 месяца. В капилляры проникают и развиваются характерные для того или иного генетического горизонта почв сообщества микроорганизмы.
Часто микробиологи, занимающиеся изучением почвенных микроорганизмов, используют метод аппликаций, который учитывает микробиологическую активность почвы и отдельных представителей почвенного микромира. Для этого полоски бумаги, состоящие, как известно, из целлюлозы или хлопчатобумажного полотна, закрепляют на стекле и закапывают в почву на определенную глубину на срок до трех месяцев. Микробиологическая активность, в данном случае целлюлозоразрушающих микроорганизмов, оценивается по скорости разложения целлюлозы (количеству разрушенной ткани или бумаги).
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1818 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
|