АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЕЕ КАЧЕСТВА

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕИ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П. А. КОСТЫЧЕВА»

(ФГБОУ ВПО РГАТУ)

ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

КАФЕДРА ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ, ХИРУРГИИ,

АКУШЕРСТВА И ВНУТРЕННИХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Е. В. КИСЕЛЕВА, Л. В. НИКУЛОВА

СПЕРМА

И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЕЕ КАЧЕСТВА

Учебно-методическиеуказания по дисциплине «Акушерство и гинекология»

для проведения лабораторных занятий и самостоятельной работы

со студентами по направлению подготовки (специальности)

111801 – Ветеринария, квалификация (степень) «специалист»

Рязань, 2014

Учебно-методическое пособие составлено с учетом требований федерального государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования (ФГОС ВПО) по направлению подготовки (специальности) 111801 – Ветеринария, квалификация (степень) «специалист», утвержденного Министерством образования и науки Российской Федерации 23 декабря 2010 года, приказ № 2021.

Учебно-методическое пособие разработано кандидатом биологических наук, доцентом Е. В. Киселевой и кандидатом биологических наук, доцентом Л. В. Никуловой и предназначено для подготовки студентов по направлению подготовки (специальности) 111801 – Ветеринария, квалификация (степень) «специалист».

В учебно-методических указаниях представлены указания для проведения лабораторных занятий и самостоятельной работы по разделу «Сперма и методы оценки ее качества».

Рецензенты:

кандидат биологических наук, доцент кафедры ВСЭ, хирургии, акушерства и ВБЖ Н. В. Фионин;

кандидат ветеринарных наук, зав. кафедрой эпизоотологии, микробиологии и паразитологии И. А. Кондакова.

Учебно-методическое пособие обсуждено на заседании кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы, хирургии, акушерства и внутренних болезней животных 27 января 2014 г., протокол № 7.

Заведующий кафедрой Э. О. Сайтханов

Одобрено учебно-методической комиссией факультета ветеринарной медицины и биотехнологии 7 февраля 2014 г., протокол № 6.

Председатель учебно-методической

комиссии факультета ветеринарной

медицины и биотехнологии Д. В. Новиков

ВВЕДЕНИЕ

Сперма – смесь спермиев (половых клеток самца) и плазмы (сыворотки). По химическому составу сперма относится к наиболее сложным жидкостям организма. Около 90-98% её массы составляет вода, 2-10% - сухое вещество, из которого 60% - белок. Главные составные части спермы – белки и липиды. В состав белка входят аминокислоты, содержащие серу. Из липидов первое место занимает лецитин, содержащий значительное количество фосфора.

В сперме содержатся сложные органические соединения: фосфаген, холестерин, мочевина, холин, лимонная кислота. Соли лимонной кислоты – элементы буферной системы спермы, поэтому добавление к ней лимонно-кислого натрия удлиняет переживаемость спермиев.

В сперме выявляются ферменты гиалуронидаза, пероксидаза, катала-за, трипсин, амилаза, липаза и другие, найдены аскорбиновая кислота, тиамин, рибофлавин, ретинол.

Важное место в химическом составе спермы занимает сахар (особенно фруктоза), являющийся источником энергии спермиев.

Для практики искусственного осеменения важно знать качество спермы, а именно густоту и подвижность, количество патологических спермиев, концентрацию спермиев, влияние физических и химических факторов на спермии, а также правила разбавления, замораживания и оттаивания спермы.

1. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭЯКУЛЯТА

1.1. Оценка качества эякулята по внешним показателям

Материалы и оборудовиние. Свежеполученная сперма, спермоприём-ники градуированные, пробирки, мерные цилиндры, салфетки, спиртовые тампоны.

Взятый эякулят подвергают макроскопической оценке. Сперму оценивают визуально по объёму, цвету, консистенции, запаху.

Объём. Объём эякулята быка и барана определяют с помощью гра-дуированного спермоприёмника, пробирки, а эякулят жеребца и хряка мен-зуркой или мерным цилиндром. Объём эякулята в одноразовом спермопри-ёмнике определяют путём взвешивания. Масса 1 г спермы соответствует 1 мл (таблица 1).

Таблица 1 – Объем эякулята у самцов с.-х. животных

Если производитель выделяет слишком мало спермы, это свидетельствует не только о нарушении рефлекса эякуляции, но и о серьёзных погрешностях в кормлении, содержании, эксплуатации.

Цвет. Сперму осматривают при хорошем освещении. У быка и барана нормальная сперма белого цвета с желтоватым оттенком. У хряка и жеребца – молочно-белая с сероватым оттенком.

Розовый и красный цвет спермы означает, что в неё попала кровь. Зеленоватый цвет указывает на наличие гноя. Интенсивно жёлтое окрашивание отмечается при попадании мочи.

Консистенция. Нормальная сперма барана имеет сметанообразную консистенцию, быка – сливкообразную, у хряка и жеребца – водянистую. Консистенция должна быть однородной. Наличие хлопьев, примесей свиде-тельствует о низком качестве спермы.

Запах. Нормальная сперма не имеет особого запаха. Иногда сперма быка может иметь слабый запах парного молока, а барана – жиропота.

Наличие гнилостного запаха указывает на патологические процессы в половых органах производителя.

Если внешние признаки эякулята имеют отклонение от нормальных показателей, то такую сперму бракуют и для работы не используют. Производитель должен быть всесторонне исследован и подвергнут соответствующему лечению. Ему необходимо создать особый режим содержания и использования.

1.2. Определение густоты и подвижности спермиев

Материалы и оборудование. Свежеполученная сперма, микроскопы, стеклянные палочки, пипетки, термостолики (столики Морозова), 2,9%-ный раствора натрия лимоннокислого, салфетки, спиртовые тампоны, предметные и покровные стекла.

Определение густоты спермы. Густота спермы зависит от количества спермиев в эякуляте и степени разбавления спермы секретами придаточных половых желез. Оценку густоты производят под микроскопом в раздавленной капле.

Подготовка микроскопа к работе. На малом увеличении (объектив 8, окуляр 15) устанавливают равномерное освещение поля зрения.

Спермии лучше просматривать в неярком свете. Для этого прикры-вают диафрагму и опускают конденсор микроскопа. На предметный столик микроскопа помещают термостолик или обогревательный столик Морозова. В обогревательный столик предварительно наливают горячую воду (60 – 65 С). Через боковое отверстие в обогревательном столике измеряют температуру. К моменту оценки она должна составлять 40-42°С.

Приготовление препарата. На чистое обезжиренное предметное стекло стеклянной палочкой или пипеткой наносят каплю исследуемой спермы и накрывают покровным стеклом, таким образом, чтобы под стеклом не образовались пузырьки воздуха.

Свежеполученная сперма очень чувствительна к температурным колебаниям. Чтобы не допустить температурного шока спермиев предметное стекло должно быть тёплым, а температура воздуха в лаборатории не менее 20 С.

В зависимости от насыщенности спермиями неразбавленная сперма может иметь следующие оценки: густая (Г), средняя (С), редкая (Р).

Сперму считают густой, когда все поле зрения микроскопа заполнено спермиями. Между отдельными спермиями почти не видно промежутков. В густой сперме трудно различить движение отдельных спермиев.

Средняя сперма – в поле зрения заметны промежутки между спермиями, хорошо различимо движение отдельных спермиев.

Редкая сперма – спермии размещены в поле зрения микроскопа так, что между отдельными спермиями имеются промежутки, значительно боль-ше размера самих спермиев.

Неразбавленная сперма производителей сельскохозяйственных животных в зависимости от густоты содержит в 1 мл следующее количество спермиев (таблица 2):

Таблица 2 - Концентрация спермиев

Олигоспермия – слишком малое количество спермиев в эякуляте.

Аспермия – отсутствие спермиев в сперме.

К использованию допускается: сперма барана – только густая, сперма быка, хряка, жеребца – густая и средняя.

Определение подвижности спермиев. Оценку качества спермы по подвижности спермиев проводят под микроскопом в раздавленной капле, как правило, после определения густоты.

Различают следующие виды движения спермиев: прямолинейно – по-ступательное (нормальное), манежное и колебательное (не нормальное), кро-ме того, спермии могут быть неподвижными.

Прямолинейно – поступательное движение (ППД) характеризуется правильным линейным перемещением спермиев в поле зрения. Только спермии, обладающие прямолинейным поступательным движением способны двигаться самостоятельно в половых путях самки и участвовать в процессе оплодотворения.

Манежное (круговое) движение (М) характеризуется вращением спермия вокруг головки или по небольшому кругу. У млекопитающих такой вид движения считается ненормальным. Манежное движение свидетельствует о неполноценности спермия, дефектах отдельных его частей, оболочки или изменения электрического потенциала.

Колебательное движение (К) – характеризуется слабым движением хвоста спермия, не приводящим к перемещению последнего. Колебательное движение признак неполноценности или наступающей гибели спермия.

Неподвижные спермии (Н) – некроспермия свидетельствует о их гибели.

Подвижность спермиев оценивают по 10-ти бальной системе. Каждый л равен 10% спермиев, обладающих прямолинейно – поступательным движением. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой все (100%) спермиев имеют прямолинейно – поступательное движение (ППД). При оценке 9 баллов – 9 спермиев из каждых 10 имеют ППД. Другие виды движения (колебательное, манежное) не учитывают. При оценке спермы по густоте и подвижности спермиев применяют комплексное обозначение. Например, Г – 9, это означает, что исследуемая сперма густая и 90% спермиев обладает прямолинейно – поступательным движением и т.д. В отдельных, особенно густых эякулятах, в момент взятия спермы, не все спермии успевают полностью выйти из состояния неподвижности, про-являя при этом слабое движение. Такую сперму необходимо исследовать после добавления к ней подогретого до 38-40 С 2,9%-ного раствора натрия лимо-ннокислого.

Рисунок 1 - Оценка спермы по густоте

Рисунок 2 - Оценка спермы по подвижности

А – 10 баллов; Б – 8 баллов; В – 6 баллов; Г – 4 балла; Д – 2 балла; Е – Н

(некросперия)

1.3. Определение процентного отношения нормальных
и патологических форм спермиев

Материал и оборудование: сперма, предметные стекла, фильтровальная бумага, пипетки, стеклянные палочки, дистиллированная вода, толстостенная стеклянная емкость, подставки, микроскоп, иммерсионное масло, 0,9% раствор натрия хлорида, емкость на 10 мл, 2% раствор эозина.

В каждом эякуляте могут содержаться деформированные спермии (патологические). Увеличение их количества выше допустимых пределов свидетельствует о патологических процессах в половых органах самца.

К числу патологических форм спермиев относят: гигантские и карликов-ые, с деформацией головки, с двумя головками, с надломом шейки, изолированные головки, с искривленным или закругленным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и др.

Свежеполученную сперму с целью уменьшения концентрации спер-миев и удобства подсчета в мазке необходимо разбавить раствором натрия хлорида. Сперму барана разбавляют в 20-30 раз, сперму быка в 10-15 раз, сперму хряка и жеребца в 2-3 раза. На предметном стекле делают тонкий мазок спермы методом стекающей капли. Для чего на один конец предметного стекла пипеткой наносят каплю и дают ей стечь, удерживая стекло под углом 40-50⁰. Приготовленный мазок высушивают на воздухе, а затем фиксируют. Для фиксации предметное стекло кладут горизонтально на специальную под-ставку и с помощью глазной пипетки на всю поверхность мазка наносят 96⁰ спирт-ректификат. Через 1-2 минуты зафиксированный мазок ополаскивают дистиллированной водой и окрашивают. Окраску проводят 2%-ным раствором эозина. На мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, и глаз-ной пипеткой, обильно наносят раствор эозина. Через 4-5 минут полоску фильтровальной бумаги снимают, а краску смывают дистиллированной водой. Мазок высушивают на воздухе, предварительно удалив фильтровальной бумагой капли воды.

Исследование мазка проводят под увеличением 400-600 раз. Передвигая мазок, подсчитывают в каждом поле зрения все спермин. Учитывают от-дельно нормальные и патологические. Общее количество подсчитанных спермиев должно быть не менее 500.

Вычисляют процент патологических.

Пример: Всего подсчитано 500 спермиев, в том числе 50 патологических.

500 – 100%

50 – Х

Х = (50 * 100)/500 = 10%

Чем меньше в эякуляте производителя патологических спермиев, тем выше оплодотворяющая способность спермы. Максимальный допустимый процент спермиев в сперме: барана – 14%, быка – 18%, хряка и жеребца – 20%.

Рисунок 3 - Нормальные и патологические формы спермиев

1 – нормальные; 2 – гигантские и карликовые; 3 – с деформацией головки; 4 – с надломом шейки; 5 – бесхвостые и с укороченными хвостами; 6 – с деформацией хвоста; 7 – с цитоплазматической каплей и утолщением тела; 8 – двухвостые, двухголовые и прочие патологические формы.

1.4. Определение концентрации спермиев в сперме производителей

Определение концентрации спермиев в счетной камере.

Материал и оборудование: сперма, микроскопы, счетные камеры (с

сеткой Горяева), смесители (меланжеры) для эритроцитов и лейкоцитов, покровные стек-ла, 3%-ный раствор натрия хлорида, 96%--ный спирт, эфир, марлевые салфетки, ват-ные тампоны.

Концентрация спермиев в сперме — это степень насыщенности спермы сперматозоидами. Она выражается количеством спермиев в 1 мл в миллиардах.

Определение концентрации спермиев в сперме складывается из: раз-бавления спермы в смесителе; подготовки счетной камеры; зарядки счетной камеры; подсчета спермиев; вычисления концентрации исследуемой спермы.

Разбавление спермы в меланже. Для определения концентрации спермиев необходимо разбавить сперму в строго определенное количество раз. Для спермы быка и барана применяют эритроцитарный смеситель (с красным шариком), а для спермы хряка и жеребца - лейкоцитарный (с белым шариком) (рисунок 4).

В меланжер набирают сперму до метки 0,5, а затем 3-ный раствор натрия хлорида до верхней метки. Эту работу необходимо выполнить очень точно. Зажимают большим и указательным пальцами оба конца меланжера и встряхивают его в течение 2-3 минут до полного перемешивания спермы с раствором.

Подготовка счетной камеры. Счетная камера с сеткой Горяева — это

толстое предметное стекло, поверхность которого бороздками разделена на три части. На среднем, окруженном бороздками поле, находится счетная сет-ка, площадь которой равна 9 мм². Это поле разделено на 225 больших квадратов, из них 25 в свою очередь разделены на 16 малых квадратиков. Пло-щадь каждого малого квадратика составляет 1/400 мм².

Счетную камеру и покровное стекло протирают тампоном, смочен-ным в смеси спирта и эфира (поровну). Вытирают насухо марлевой салфеткой. Покрывают камеру покровным стеклом и притирают стекло к крайним пластинкам до появления радужных колец.

Зарядка счетной камеры. Из капилляра меланжера удаляют на сухой тампон первые 2-3 капли разбавленной спермы, 4-5-ую капли наносят на среднюю часть камеры у самого края притертого покровного стекла.

Подсчет спермиев. Камеру помещают на предметный столик микроскопа. Под малым увеличением находят сетку камеры, а затем переводят увеличение в 200-300 раз. Подсчет спермиев производят в 5-ти больших квадратах, которые разделены на маленькие. Считают в квадратах расположенных по диагонали или по углам и в центре. Считают головки спермиев, расположенные внутри маленьких квадратов, и на верхней и левой линиях.

Рисунок 4 - Смесители (меланжеры)

Вычисление концентрации спермиев. Концентрацию спермиев определяют по формуле:

С = (400 П.Д)/(N Р.1000000),

где: С - концентрация спермиев;

П — число подсчитанных спермиев;

Д — степень разбавления;

N - число сосчитанных малых квадратов (80);

Р - глубина камеры (О, 1 мм); 400 - множитель, введен в формулу для пересчета в 1 мм, так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм².

Для точности определения концентрации спермиев рекомендуется заправлять обе сетки и при подсчете брать средний показатель. Расхождение результатов не должно превышать 10%. Если разница больше 10%, подсчет повторяют третий раз и берут среднее из двух подсчетов, расходящихся не более чем на 10%.

Определение концентрации спермиев на фотоэлектроколориметре

ФЭК-М.

Материал и оборудование: сперма, фотоэлектроколориметр, 3,5%-ный раствор натрия цитрата, микропипетки (0,1 см³), мерные пипетки (10 см³), сухие чистые флаконы или пробирки, марлевые салфетки, фильтровальная бумага, смесь этилового спирта и эфира (поровну), дистиллированная вода, чашка толстостенная емкостью 0,5 литра.

Метод определения концентрации спермиев при помощи ФЭК-М основан на способности спермы ослаблять пропускаемый через нее пучок света пропорционально концентрации спермиев, то есть чем выше концентрация спермиев, тем больше ослабляется проходящий пучок света. Величина ослабления светового пучка регистрируется чувствительными фотоэлементами.

Определение концентрации на ФЭК-Мначинают спустя 15-20 минут после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсче-тный барабан рукояткой выставляют на «О» по красной шкале (шкала оп-тической плотности).

Во флакон наливают 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокисло-го вносят в него 0,1 мл спермы быка (сперма разбавляется в соотношении 1:100). Сперму барана разбавляют в соотношении 1: 400, то есть берут 10 мл 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого и 0,025 мл спермы. Сперму хряка -разбавляют в соотношении 1: 30, то есть к 12 мл 3,5%-ного раствора на-трия лимоннокислого добавляют 0,4 мл спермы, которая предварительно должна быть профильтрована через 2 слоя капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

Пробы спермы отбирают микропипеткой емкостью 0,1-0,5 мл из се-редины свежеполученного эякулята. Перед внесением пробы спермы в раство-р микропипетку необходимо снаружи вытереть чистой марлевой салфет-ки. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополоть в этом же растворе путем насасывания и выдувания.

Температура 3,5%-ного раствора натрия лимоннокислого должна быть в пределах 18-25 С.

После разбавления сперму тщательно перемешивают и наливают в кювету с рабочей длиной 10 мл до метки и быстро определяют оптическую плотность. Для этого на путь прохождения пучка света ставят в левый кюве-тодержатель чистую кювету с рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ч раствором натрия лимоннокислого, а в правый кюветодержатель - 2 такие-к же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как и в левом кюветодержателе), а кювету с раствором в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы необходимо устанавливать перпендикулярно к пучку света.

Закрывают крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение «1». Рукояткой нейтральных -клиньев подводят стрелку гальванометра к «0», затем включают гальванометр на высокую чувствительность, в положение «2» и точно устанавливают стрелку на «О». Затем гальванометр сразу же переводят на грубую чувствительность в положение «1». Меняют в правом кюветодержателе местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого. Это достигается путем поворота кюветодер-еля вокруг оси.

Опустив крышку прибора, опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность (не трогая ручку нейтральных клиньев) рукояткой барабана подводят отклонившуюся стрелку гальванометра на «О». Включают гальванометр на высокую чувствительность, точно устанавливают стрелку на «0», Рукоятку гальванометра переводят в положение «0».

Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой, которую выводят заранее.

Построение калибровочной кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации змиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбир-ают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия 1: 1, 1: 2, 1: 3 и т.д. готовят ряд образцов спермы и определяют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано в предыдущей методике. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси – известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной- оси – соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки, калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а число точек, лежащих выше или ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе, как указано выше и посмотреть какой причине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величин оптической плотности.

Калибровочную кривую следует ежемесячно проверять, так как пока-зания прибора могут изменяться.

Точность электрофотометрического метода определения концентрации спермиев и источник ошибок. По точности электрофотометрический метода определения концентрации спермиев почти не уступает методу опреде-ления в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах 6%.

Эта величина ошибки обусловлена в основном влиянием плазмы спермы к неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точ-ность результатов исследования ослабляется применением красных монохр-оматических светофильтров.

Электрофотометрический метод определения концентрации спермиев требует исключительной аккуратности в работе.

Основными источниками ошибок могут быть:

1. Грязные кюветы, флаконы, микропипетки и другие предметы, которые имели контакт со спермой во время ее подготовки к исследованию;

2. Неточность взятия проб спермы микропипетками;

3. Неточность в разбавлении спермы перед исследованием;

4. Всевозможные механические примеси в 3,5%-ном растворе натрия лимоннокислого;

5. Загрязнение оптики прибора в результате неаккуратной работы;

6. Несвоевременность исследования проб спермы, что может привести к их подсыханию или биологическому загрязнению (развитию микрофлоры).

Для получения точных результатов не следует допускать перечисленных недостатков в исследовании. Кювету со спермой после каждого исследован-ия необходимо прополаскивать дистиллированной водой не менее 3 раз. Остатки воды в кювете убирают промокательной бумагой, а для исследования -очередного образца спермы берут другую кювету такой же рабочей длины.

Кювету берут только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие поверхности.

После окончания работы все кюветы тщательно моют дистиллирован-ной водой. Несмываемые водой загрязнения устраняют смесью спирта с ром. Для этого используют марлевый тампон, намотанный на деревянную палочку.

Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта

Материалы и оборудование: сперма, оптический стандарт, пробирка (диаметр должен соответствовать диаметру оптического стандарта), 1%-ный раствор натрия хлорида, микропипетка (0, 1 см³), салфетки, мерная пипетка (5,0 см³), лист с печатным текстом.

В пустую пробирку вносят 1,0 мл 1%-ного раствора натрия хлорида. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спер-мы. Конец пипетки вытирают снаружи салфеткой, а затем два раза промыва-ют ее раствором в пробирке. Пробирку слегка встряхивают и держат рядом со стандартом. Стандарт предварительно должен быть хорошо взболтан. К пробиркам сзади вплотную прикладывают лист с печатным текстом.

К исследуемой сперме добавляют пипеткой 1%-ный раствор натрия хлорида в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом. Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и стандар-та совпадут, проводят расчет по формуле:

К = 50 (n + 0,1),

где: К – концентрация спермы (млн./мл);

n – объем внесенного 1%-ного раствора натрия хлорида (мл);

50 – коэффициент.

Оптический стандарт соответствует оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн./мл.

Пример: Для выравнивания оптической плотности до стандарта к ис-следуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора натрия хлорида (с учетом ранее налитого в пустую пробирку).

К = 50 х (4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 (млн./мл)

Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн. спермиев.

Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам

Материал и оборудование: сперма, стандарты.

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра, с жидкостью имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10 - 20 - 200 - 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую пустую пробирку такого же диаметра, и сравнивают со стандартом. Стандарты, предварительно встряхивают, чтобы осадок равномерно размешался. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию. Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами.

При концентрации более 500 млн. спермиев в 1 мл сперму можно разбавлять 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1: 1), затем установить концен-трацию по стандартам и сделать соответствующий пересчет на неразбавлен-ную сперму.

Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

1.5. Определение интенсивности дыхания спермиев

(активность дегидрогеназы)

Материал и оборудование: свежеполученная сперма, 0,01%-ныйраствор метиленового синего, стеклянные капилляры, стеклянные палочки, глазные пипетки, лист белой бумаги, резиновая трубка, термостат.

Метод основывается на том, что в анаэробных условиях спермин используют для дыхания кислород из молекул метиленового синего, в результате чего раствор обесцвечивается. Поскольку дыхание происходит под влиянием дегидрогеназы, то по существу скорость обесцвечивания раствора метиленового синего показывает активность названного энзима.

Для определения на теплое (30-37⁰С) предметное стекло наносят каплю, спермы и каплю метиленового синего (30 ⁰С). Капли быстро перемешивают, и смесь набирают в два теплых стеклянных капилляра длина которых должна быть не менее 5-6 см и диаметр 0,8-1,0 мм. Длина столба в трубке должна быть примерно 2-3 см. В столбе смеси не должно быть пузырьков воздуха. Капилляры кладут горизонтально и помещают в термостат (+ 37 ⁰С) на белую бумагу. Регистрируют время (таблица 3), в течение которого обесцвечивается раствор метиленового синего.

Таблица 3 - Оценка качества спермы по времени обесцвечивания метиленовой сини (в минутах)

Результат является более объективным, если вычисляют и активность дегидрогеназы, поскольку с помощью этого показателя учитывается как подвижность спермиев, так и их концентрация.

Активность дегидрогеназы в условных единицах получают по формуле:

Да = (Пс×t×С)/10, где:

Да – активность дегидрогеназы;

Пс – подвижность спермиев в баллах;

t – время обесцвечивания раствора метиленового синего в минутах;

С – концентрация спермиев (млрд./мл).

Допустимая активность дегидрогеназы должна быть в сперме быка в пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е. пределах 16,8 у. е., для барана 9,6 у. е.

1.6. Определение абсолютной выживаемости спермиев

Материал и оборудование: сперма, микроскопы, обогревательные столики, сухие стерильные пробирки с пробками на 2 мл, стерильные мерные пипетки (1-2 см³), штатив, синтетический разбавитель, термос со льдом, стерильные стеклянные палочки, предметные и покровные стекла.

Под выживаемостью спермиев подразумевают продолжительность их жизни вне организма в определенных условиях. Это важный показатель качества спермы, поскольку он дает возможность предсказать оплодотворяющую способность спермы. Выживаемость спермиев выражается абсолютной выживаемостью (S).

Для определения абсолютного показателя выживаемости спермиев берут 11 стерильных пробирок емкостью по 2 мл и нумеруют восковым карандашом. Во все пробирки, за исключением первой, наливают по 0,5 мл синтетической среды. В первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка в дальнейшем служит контролем.

Сперму во второй пробирке тщательно перемешивают со средой путем пипетирования и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь перемешивают и переносят в четвертую и т.д. Из последней пробирки (11-ой) 0,5 мл смеси выливают. Таким образом, в первой пробирке сперма не разбавленная, а в пробирках со 2 по 11-ую сперма разбавлена в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 раза.

Из каждой пробирки на теплое предметное стекло берут каплю, спер-мы и оценивают подвижность. Пробирки устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение в термос со льдом.

В последующем ежедневно оценивают подвижность спермиев под микроскопом при температуре 40 ⁰С. Оценку подвижности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. Показатель абсолютной выживаемости (S) определяют по формуле:

S = а ₁t ₁ + а ₂t ₂ + a ₃t ₃+... a _nt _n

где: а ₁, а ₂, а ₃ , а_n – подвижность спермиев за интервалы времени, в балах;

t₁ , t ₂ , t ₃ , t_n – последовательные интервалы времени, в часах. Интервалы времени в часах определяются по формуле:

t = (Т n+1 - Т n-1)/2

где: Т – часы опыта,

Т n+1 - время в часах от начала опыта до последующего опреде-ления подвижности;

Т n-1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определе-ния подвижности.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости спермиев не ниже 1 400, хряка - 900, жеребца - 400 и выше.

2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА

Микробиологическое исследование эякулята проводят один раз в квартал. Для микробиологического исследования в лабораторию направляют 1 мл эякулята. Если для транспортировки требуется более двух часов, то материал в пробирке перевозят в термосе со льдом. Промежуток времени от взятия спермы до посева её должен превышать более шести часов. В лаборатории из спермы делают разбавления 1: 10, 1: 100 и 1: 1000. Для этого в каждую пробирку вводят 4,5 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 0,5 мл неразбавленной спермы. После перемешивания из первой пробирки во вторую вносят 0,5 мл. В третью пробирку из 2-ой 0,5 мл.

Микробиологическим исследованием устанавливают содержание микробов в 1 см³ эякулята, наличие грибов, коли-титр.

2.1. Определение содержания микробов 1 см³ эякулята

Материал и оборудование: эякулят разбавления 1: 100, стерильные чашки Петри, МПА с 1% раствором глюкозы, стерильные палочки Дригальского, стерильные пипетки на 1 см³, термостат, водяная баня.

Посевы делают на четыре чашки Петри. Для этого на среду наносят стерильной пипеткой 0,5 см³ разбавленной 1: 100 спермы и равномерно покрывают ею всю поверхность. После посева чашки Петри помещают на 48 часов в термостат при температуре 37,5 ⁰С (0,5 ⁰С). Если сперма слабо за-грязненная, то колонии подсчитывают по всей поверхности чашки. При сильной загрязненности поверхность чашки разделяют на несколько секторов, подсчет колоний производят только в одном секторе. Количество микробов в 1 см³ эякулята (С) вычисляют по формуле:

С = - (N×Д)/(V×S), где:

N–количество подсчитанных колоний;
Д – степень разбавления спермы;

Ч – количество посеянной спермы (см³);

S – площадь сектора, на которой проводили подсчет колоний (1/4, 1/2 и т.д. из площади чашки Петри).

Вычисление содержания микробов в 1 см³ эякулята основывается на арифметическом среднем четырех чашек. При этом учитывают только те результаты, разница между которыми не более 20%. Определение вида и патогенности изолированных микробных штаммов производится общепризнанными методами. Эякулят быка считают годным, если он не содержит патогенных и потенциально патогенных микробов, а содержание апатогенных микробов в 1 см³ не превышает 5000.

Быков, в эякуляте которых обнаружено более пяти тысяч апатоген-ных микробов в 1 см³ или найдена си негнойная палочка, повторно исследуют не менее трех раз с интервалом 6-10 дней. Если и при этих исследованиях будет установлена та же микрофлора и в тех же или несколько меньших (до 30%) количествах, таких производителей считают бактерионосителями, от них прекращают использовать сперму, и проводят соответствующее лечение. При отсутствии лечебного эффекта производителей выбраковывают.

2.2. Определение коли-титра

Материал и оборудование: разбавленная сперма (1: 10, 1: 100, 1: 1000), стерильные пипетки, среда Бумера, термостат, среда Эндо.

Из каждого разбавления спермы делают стерильной пипеткой посевы (по 1 см³) в среду Бумера. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 43-44⁰С.

При росте кишечной палочки среда становится желтой и мутной, и в бродильной трубке накапливается газ. Из таких пробирок делают посевы на среду Эндо. Эти посевы инкубируют в термостате в течение суток. Если выросли колонии микробов с характерным ростом колоний кишечной палочки (ярко красный цвет), тогда делают мазки и окрашивают по Граму.

Пригодными к применению считают эякуляты быка, коли-титр которых не более 1: 10.

3. ВЛИЯНИЕ НА СПЕРМИИ ФИЗИЧЕСКИХ И
ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Материал и оборудование: сперма, микроскопы, предметные и покровные стекла, глазные пипетки, пипетка на 1 мл, термостолик, лед в чашке, горячая вода, 2,9% раствор натрия цитрата, 0,9% и 3% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор калия перманганата 1: 3000, 2%-ный раствор формалина, 96%-ный спирт, 5%-ная настойка йода, вата, марлевые салфетки, фильтровальная бумага.

Действие высокой и низкой температуры. Определяют подвижность спермиев в свежеполученной сперме. Помещают препарат на обогревательны-й столик с температурой 50-65 ⁰С и определяют подвижность спермиев. Вначале наблюдается усиление подвижности, а потом под влиянием высокой температуры спермин быстро погибают.

На другое предметное стекло наносят каплю спермы. Оценивают подвижность. Помещают стекло на 1-2 минуты на лед. Протирают препарат фильтровальной бумагой и проверяют подвижность при температуре 18-20 ⁰С. Все спермии остаются неподвижными. При подогревании препарата до 40 ⁰С у части спермиев подвижность восстанавливается, а остальные спермии остаются неподвижными в результате гибели от температурного шока.

Влияние гипертонического раствора. После предварительной оценки подвижности, к капле свежеполученной спермы добавляют каплю 3%-ного (гипертонического) раствора натрия хлорида, капли перемешивают, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Под влиянием гипертонического раствора спермин быстро погибают.

Влияние гипотонического раствора. На предметное стекло наносят каплю, спермы и определяют подвижность. На другое предметное стекло на-носят рядом капли спермы и дистиллированной воды. Капли, не смешивая, накрывают покровным стеклом и на границе слияния капель проводят наблюдение за спермиями.

Под влиянием дистиллированной воды (гипотоническая среда) про-исходит набухание головки спермиев, закручивание хвоста, гибель спермиев.

Влияние изотонического раствора. К капле свежеполученной спермы добавляют каплю 2,9% раствора натрия лимоннокислого. При определении подвижности отмечают активное движение спермиев.

Действие антисептиков. В свежеполученной сперме определяют подвижность. Затем к капле спермы нанесенной на предметное стекло добавляют каплю антисептика (раствор калия перманганата 1: 3000, 2%-ный раствор формалина, 96% спирт). После смешивания спермы с каплей антисептика препарат накрывают покровным стеклом и под микроскопом наблюдают. Через сколько минут наступает гибель спермиев. Если вокруг капли со спер-мой нанести в виде кольца 5% раствор йода, то йод, улетучиваясь, будет окрашивать сперму в желтый цвет. Под микроскопом можно отмечать массовую гибель спермиев от паров йода.

4. РАЗБАВЛЕНИЕ ЭЯКУЛЯТА И ЕГО ОБРАБОТКА

Во время эякуляции к спермиям добавляются секреты придаточных половых желез. Электролиты, ферменты и другие, биологически активные вещества, содержащиеся в плазме спермы разрушают липопротеидную оболочку спермиев, возбуждают их, вызывают быстрое расходование запасов питательных веществ, способствуют потере электрического заряда с поверхности спермиев и их агглютинации. Для устранения отрицательного влияния плазмы на спермии и продления срока их жизни вне организма сперму разбавляют синтетическими средами разного состава. Выбор среды зависит от физиологии спермы данного вида животного и от метода ее хранения. Наиболее часто используемые компоненты сред представлены на рисунке.

4.1. Состав сред для спермы производителей
сельскохозяйственных животных

Синтетическая среда для разбавления и хранения спермы быка в течение 72 часов при температуре 2-5 ⁰С (таблица 4):

Таблица 4 - Среда глюкозо-цитратно-желточная

Состав синтетической среды для разбавления и хранения спермы барана в течение 24 часов при температуре 2-5 ⁰С(таблица 5):

Таблица 5 - Среда глюкозо-цитратно-желточная

Рисунок 5 - Основные компоненты искусственных сред

Синтетическая среда для разбавления и хранения спермы хряка в течение 72 часов при температуре 16-20 ⁰С(таблица 6):

Таблица 6 - Среда глюкозо-хелатно-цитрато-сульфатная

Синтетическая среда для разбавления и хранения спермы жеребца в течение 48 часов при температуре 2-5 ⁰С (таблица 7):

Таблица 7 - Среда лактозо-хелато-цитратно-желточная

Таблица 8 - Синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы быка в форме гранул:

4.2. Приготовление синтетических сред

Материал и оборудование: компоненты сред, колбы, мензурки, ве-сы, пипетки градуированные, фильтроваль-ная бумага, чашки Петри, скальпель, сал-фетки, тампоны, спирт 96%, стеклянные па-лочки, термометры.

Синтетические среды готовят в день разбавления спермы из выпускаемых промышленностью сухих веществ. В стерильную химическую колбу наливают необходимый объем прокипяченной дистиллированной воды и до-бавляют все компоненты, за исключением спермосана – 3, глицерина и желт-ка согласно представленных прописей.

Среду стерилизуют в водяной бане 10 минут с момента закипания во-ды в бане, затем охлаждают до 35-40 ⁰С и добавляют спермосан, глицерин и желток.

Яйцо перед использованием моют, протирают спиртовым тампоном, раскалывают пополам и отделяют белок от желтка. Желток переносят на фильтровальную бумагу, прокалывают и сливают в измерительную мензурку.

После тщательного перемешивания среда должна быть использована в течение 4-х часов. Температура среды и спермы перед разбавлением должка быть одинаковой.

Техника разбавления спермы производителей синтетическими средами

Материалы и оборудование: свежеполученная сперма, свежеприготовленная среда, мензурки, пипетки, термометры, микроскопы, предметные и покровные стекла.

После предварительной оценки сперму разбавляют средой в соотношении 1:1 или 1:2. Через 5-10 минут среда с температурой 25-30 ⁰С небольшими порциями добавляют по стенке в колбу со спермой и осторожно перемешивают.

В зависимости от подвижности и концентрации спермиев сперму бы-ка разбавляют в 20-50 и более раз, чтобы в одной дозе разбавленной спермы для всех способов хранения перед осеменением было не менее 10 млн. спермиев с ППД 4 балла.

Сперму барана разбавляют в 2 (1: 1) – 4 (1: 3) раза с концентрацией в дозе не менее 80 млн. спермиев.

Сперму хряка разбавляют в 2 (1: 1) – 10 (1: 9) раз с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев через 30-60 мин. после взятия и определения ее качества.

Сперму жеребца разбавляют в 4 (1: 3) раза с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев.

Рисунок 6 - Извлечение желтка для искусственной среды

5. ПОДГОТОВКА ГЛУБОКОЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ
К ОСЕМЕНЕНИЮ

Материал и оборудование: глубокозамороженная сперма, водяная баня (биологический термостат, оттаива-тель), микроскопы, термостолики, предметные и покровные стекла, 2,9%-ный раствор натрия лимоннокислого, термометр, пипетки, корнцанг, пинцет, тампоны спиртовые, салфетки.

Оттаивание глубокозаморожеякой спермы в различной расфасовке – в необлицованных гранулах, соломинках (пайэтах), облицованных гранулах (капсулах, пилеттах), пакетах, является ответственной операцией, которая требует определенных навыков и строгого выполнения целого ряда правил.

До начала оттаивания необходимо подготовить все инструменты, водяную баню (биологический термостат, оттаиватель спермы), микроскоп с термостоликом кработе.

Температура воды в водяной бане (биологическом термостате) должна быть в пределах 40-42 ⁰С.

6. ОТТАИВАНИЕ ГЛУБОКОЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ БЫКА

Оттаивание спермы быка с необлицованных гранулах объемом 01-0 2 мл. В гнездо штатива помешают простерилизованный флакон или ампулу с 2,9%-ным раствором натрия лимоннокислого (1 мл). Ампулу предварительно вскрывают, исключая при этом попадание стекла внутрь. Вскрыть ампулу необходимо в расширенной части, для обеспечения свободного прохождения гранулы. Выдерживают флакон (ампулу) с раствором натрия лимоннокисло-го в водяной бане не менее 3-х минут при температуре 40-42⁰С.

Стерильный корцанг или пинцет вносят в горловину сосуда Дьюара и охлаждают в парах азота. Охлажденным корцангом или пинцетом берут гранулу из канистры (тубы, контейнера) и быстро переносят в подготовленный для оттаивания флакон или ампулу. Не вынимая из воды, круговыми движениями покачивают флакон или ампулу до полного растворения гранулы. Процесс таяния обычно продолжается 7-8 секунд. После этого флакон (ампулу) со спермой вынимают из воды и ставят на стол. Температура в помещении лаборатории должна быть не менее +20⁰С.

Нельзя помещать при оттаивании во флакон (ампулу) больше одной ранулы.

Оценивают подвижность спермиев под микроскопом в раздавленной капле.

Оттаивание гранул спермы объемом 0 5 мл. Для осеменения коров и телок может поступать сперма замороженная в гранулах объемом 0,5 мл, не требующая при оттаивании дополнительного внесения 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого. Для оттаивания такой спермы необходимо стерильным, предварительно охлажденным пинцетом или корцангом взять из сосуда Дьюара две гранулы (доза спермы) и поместить их в стерильный стеклянный флакон, подогретый на водяной бане (биологическом термостате) до 40-42 ⁰С. Флакон с гранулами, не вынимая из воды осторожно вращают круговыми движениями до полного таяния гранул, после чего флакон переносят на ла-бораторный стол при комнатной температуре (не менее +20 ⁰C).

Время таяния двух гранул объемом 0,5 мл составляет 1,5-2 минуты.

Нельзя в один флакон помещать более двух гранул.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Оцените визуально свежеполученную сперму быка, барана, хряка, жеребца.

2. Дайте комплексную оценку по густоте и активности свежеполученной спермы быка.

3. Дайте оценку активности размороженной спермы быка.

4. Определите процентного отношения нормальных

и патологических форм спермиев спермы быка.

5. Определите концентрацию спермиев в сперме быка и хряка.

6. Определете интенсивности дыхания спермиев быка.

7. Опишите влияние различных факторов внешней среды на спермии.

8. Опишите и проведите размораживание спермы быка.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных/ А.П.Студенцов, В.С. Шипилов, и др. – М.:КолосС, 2005.

2. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных/ В. Я. Никитин, М. Г. Миролюбов и др. - М.: КолосС, 2004.
3. Козло Н.Е. Воспроизводство животных / Н.Е. Козло. -М.: Колос, 1984.

4. Турков, В.Г. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных/ В.Г. Турков.- Иваново, 1999.

5. Полянцев, Н.И. /Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных/Н.И.,Полянцев, В.В.,Подберезный. – Феникс: –Ростов-на-Дону,2001.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение …………………………………………………………………………………3

1. Оценка качества эякулята…………………………………………………………….4

1.1. Оценка качества эякулята по внешним показателям ………………………….…4

1.2. Определение густоты и подвижности спермиев …………………………………5

1.3. Определение процентного отношения нормальных и патологических форм спермиев …………………………………………………………………………………8

1.4. Определение концентрации спермиев в сперме производителей ……………..10

1.5. Определение интенсивности дыхания спермиев………………………………..16

1.6. Определение абсолютной выживаемости спермиев…………………………….17

2. Микробиологическое исследование эякулята ………………………………….…18

2.1. Определение содержания микробов в 1 см³ эякулята…………………………..18

2.2. Определение коли-титра …………………………………………………………19

3. Влияние на спермии физических и химических факторов……………………….20

4. Разбавление эякулята и его обработка …………………………………………….21

4.1. Состав сред для спермы производителей сельскохозяйственных животных………………………………………………………………………………………21

4.2. Приготовление синтетических сред……………………………………………...24

5. Подготовка глубокозамороженной спермы к осеменению……………………….25

6. Оттаивание глубокозамороженной спермы быка ………………………………...25

Список использованной литературы ………………………………………………..27

Содержание …………………………………………………………………………….28

Дата добавления: 2015-11-02 | Просмотры: 923 | Нарушение авторских прав