АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы работы с генным материалом

Прочитайте:
  1. I. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  2. II МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  3. II. Методы, подход и процедуры диагностики и лечения
  4. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  5. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  6. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  7. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  8. II. Подготовительные работы Конвенции 1883 г.
  9. II. Порядок выполнения работы
  10. II. Порядок выполнения работы

Трудности в изучении DNA заключаются в следующем:

  1. молекулы DNA животных и человека имеют огромные размеры. Такие молекулы неудобны для исследования и их предварительно разрезают, фрагментируют с помощью специальных ферментов - рестриктаз, выделяемых из бактерий. Рестриктазы «узнают» определенные последовательности и разрезают DNA в определенных местах;
  2. количество DNA в клетке невелико, поэтому необходим способ умножения (амплификации) изучаемой DNA in vitro. Таким методом является полимеразная цепная реакция - PCR, которая позволяет амплифицировать DNA или ее фрагмент в миллионы раз за несколько часов.

PCR осуществляют в пробирке с помощью термостабильной DNA-полимеразы (Tag-полимеразы) при участии дезоксинуклезидтрифосфатов - субстратов и коротких олигонуклеотидных затравок - праймеров. Праймер - это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов одноцепочечные фрагменты DNA, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой DNA-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент DNA, который будет скопирован Tag-DNA-полимеразой, присоединяющейся к 3’-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины. Реакция происходит в несколько стадий:

Стадии одного цикла PCR

  • Денатурация. Инкубационную смесь нагревают до 90о. При этом происходит разрушение слабых связей в DNA и из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепочечные.
  • Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50о. При этом происходит гибридизация цепей DNA с праймерами.
  • Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до 70о. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. В результате количество DNA удваивается. Tag-полимераза выделяется из термофильных бактерий и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70о гибрид праймер - DNA не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 453 | Нарушение авторских прав

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)