Попущено Министерством сельского хозяйства Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений по специальности 310800 «Ветеринария»
Ф
МОСКВА «КОЛОС» 2001
Редактор В. В. Ракитская
Рецензент профессор П. Ф. Сонин (С.-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины)
Костенко Т. С., Родионова В. Б., Скородумов Д. И. Практикум ветеринарной микробиологии и иммунологии. — М.: Колос, 2001. — 344 с: ил. — (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений). ISBN 5-10-003507-2.
Изложены методы бактериологических и серологических исследований, приведены схемы лабораторной диагностики бактериозов и микозов сельскохозяйственных животных.
Каждая тема содержит методические указания, перечень материалов, необходимых для проведения занятия, задания для самостоятельной работы и контрольные вопросы для самопроверки.
Практикум может быть полезен при проведении факультативных занятий. -
Для студентов вузов по специальности «Ветеринария».
УДК 616.9:619(076.5)
ББК 48.73я73
ISBN 5-10-003507—2
Раздел I
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
•
Тема 1
ВЕТЕРИНАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия. Ознакомить студентов с назначением бактериологической лаборатории, ее основным оборудованием и правилами техники безопасности; с принципами фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной, электронной микроскопии. Освоить микроскопическое исследование бактериальных препаратов с применением иммерсионной системы. Изучить основные формы бактерий и методику определения их размеров.
Оборудование и материалы. Термостаты, микроанаэростаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклавы, центрифуги, вакуумные насосы, дистиллятор, водяные бани, потенциометр (рН-метр), фильтры, лабораторная посуда, световой, люминесцентный и электронный микроскопы, темнопольный конденсор, фазово-контрастное устройство, окуляр- и объект-микрометры, готовые препараты с бактериями, иммерсионное масло.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Ветеринарно-бактериологическая лаборатория. Это учреждение Государственной ветеринарной службы РФ. Различают районные, межрайонные, областные (краевые) и республиканские лаборатории. В их задачи входят: проведение бактериологических, серологических, вирусологических, микологических, биохимических, патологоанатомических и других исследований для установления лабораторного диагноза болезней животных всех видов, проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.
Лаборатории размещают в специальном здании с дифференциацией на отделы. Например, для межрайонных и районных ветеринарных лабораторий предусмотрены бактериологический, серологический и химико-токсикологический отделы. Выделяют помещение для вивария, где содержат экспериментальных животных (мыши, морские свинки, кролики и т. д.), а также баранакак донора крови, необходимой для приготовления питательных сред и постановки серологических реакций (РСК). Зараженных и здоровых животных содержат в разных комнатах вивария.
В бактериологической лаборатории оборудуют боксы. Под них отводят отгороженную стеклянной переборкой часть помещения или две-три смежные комнаты. В боксе работают, когда необходимо предотвратить контаминацию (загрязнение) окружающей среды патогенными микроорганизмами или исследуемых культур посторонней микрофлорой. Перед работой воздух и стенки бокса обеззараживают ультрафиолетовыми лучами бактерицидных ламп.
В отдельных помещениях лабораторного корпуса моют посуду, инструменты (моечная), готовят питательные среды (бактериологическая кухня), стерилизуют посуду, среды, спецодежду, обеззараживают культуры бактерий и инфекционный материал (автоклавная).
Правила техники безопасности в ветеринарно-бактериологической лаборатории. Работа в бактериологических лабораториях сопряжена с опасностью заразиться самим или заразить других патогенными микроорганизмами. Для студентов ветеринарных вузов лабораторией служит кафедра микробиологии. Сотрудники бактериологических лабораторий и кафедры микробиологии, аспиранты, студенты, приходящие на занятия или для работы в научно-студенческих кружках, обязаны ознакомиться с правилами техники безопасности и строго их соблюдать.
Входить в помещение лаборатории и работать в ней разрешается только в специальной одежде — халате и головном уборе (шапочка, косынка). Халат должен быть застегнут, волосы подобраны.
Не разрешается вносить посторонние предметы; личные вещи (портфели, сумки) оставляют в отведенных для этой цели местах.
Категорически запрещается курить и принимать пищу.
Перед началом работы проверяют исправность приборов (газовых и спиртовых горелок). О всех неисправностях сообщают ответственному лицу лаборатории, на учебных занятиях — преподавателю.
Не разрешается зажигать одну горелку от другой во избежание взрыва. Для зажигания горелок используют только спички.
Электроприборы включают с разрешения преподавателя или обслуживающего персонала кафедры. Запрещается касаться проводов и контактных частей электросети.
Рабочее место и оборудование содержат в чистоте, соблюдают опрятность в работе.
Исследуемый материал должен рассматриваться как особо опасный. При работе с ним необходимо соблюдать принятые в микробиологической практике технические правила, исключающие возможность заражения работника.
Движение культур микроорганизмов (посев, хранение, уничтожение) регистрируют согласно действующей инструкции в специальном журнале.
В случае попадания материала или культур микроорганизмов на пол, стол и т. д. обрабатывают эти поверхности дезинфицирующим раствором.
После окончания работы использованный материал (патологический материал, бактериальные, грибные культуры, инструменты и др.) студенты отдают преподавателю или лаборанту для обеззараживания, рабочее место тщательно убирают и дезинфицируют; моют и дезинфицируют руки, халаты и головные уборы складывают в полиэтиленовые пакеты.
После ознакомления с правилами техники безопасности на кафедре микробиологии студенты расписываются в журнале преподавателя.
Основное оборудование диагностических бактериологических лабораторий. Лаборатории в обязательном порядке оснащены следующим оборудованием.
Термостат используют для культивирования микроорганизмов в аэробных условиях. Это шкаф с двойными стенками, пространство между которыми заполнено водой или воздухом; снабжен устройством для поддержания постоянной температуры в диапазоне 28...43 °С (стабильную температуру лучше поддерживают водяные термостаты).
Микроанаэростаты необходимы для культивирования клеток в анаэробных условиях (см. тему 7); представляют собой герметические емкости, из которых с помощью насоса удаляют воздух и затем помещают в термостат.
Печь Пастера и автоклав служат для стерилизации инструментов, лабораторной посуды, питательных сред, спецодежды и т. д. Их устройство и принцип работы подробно изложены в теме 6.
Холодильники бытовые (4...6 °С) и низкотемпературные (-20 °С и ниже) используют для хранения питательных сред, культур микроорганизмов, вакцин, сывороток, поступившего для бактериологического исследования материала.
Центрифуги настольные, рефрижераторные (для разделения компонентов в условиях низких температур), микроцентрифуги предназначены для осаждения микроорганизмов, отделения форменных элементов от плазмы крови и др.
Помимо перечисленного оборудования в лаборатории необходимы: вакуумные насосы, дистиллятор, технические и аналитические весы, водяные бани, потенциометр, керамические, асбестовые и мембранные фильтры, аппараты для изготовления ватно-марлевых пробок, лабораторная посуда — чашки Петри, бактериологические и серологические пробирки, пластиковые планшеты для культуральных работ и микротитрования, колбы, мерные цилиндры, матрацы, градуированные и пастеровские пипетки, специальные инструменты — бактериологические петли, иглы, шприцы, пинцеты, шпатели, ножницы и т. д.
Техника микроскопирования. Микроскопы, дающие увеличение в сотни (световой) или тысячи раз (электронный), используют для изучения морфологии и строения микроорганизмов. Бактериологические лаборатории снабжены микроскопами различных типов: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др.
Световой микроскоп. Основные узлы световых микроскопов показаны на рисунке 1.
К механическим частям микроскопа относят штатив, состоящий из основания и тубу содержателя. К тубусодержателю 12 прикреплены: тубус 14, револьвер 18— вращающийся диск с гнездами для объективов и предметный столик 20 с клеммами 5, фиксирующими предметное стекло с изучаемым объектом. Тубус передвигают вверх-вниз при помощи макро- 2 и микрометрического 1 винтов.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, зеркала, апертурной диафрагмы, конденсора, объективов и окуляров. Зеркало 23 подвижно закреплено под конденсором, одна его поверхность
плоская, другая — вогнутая. При работе с конденсором используют плоскую, без конденсора — вогнутую поверхность зеркала. Конденсор 21 применяют для концентрирования отраженных зеркалом лучей света, фокус которых должен находиться в плоскости препарата. Верхняя линза конденсора плоско-выпуклая, нижняя — двояковыпуклая. Под конденсором помещена апертурная (ирисовая) диафрагма 22. Изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света, регулируют интенсивность освещения поля зрения.
Объективы 19 состоят из нескольких линз, заключенных в металлическую оправу. Только одна линза — фронтальная — выполняет функцию увеличения, остальные предназначены для коррекции изображения. Под рабочим расстоянием объектива понимают расстояние от плоскости фронтальной линзы до изучаемого объекта при нахождении последнего в фокусе. Чем больше увеличение объектива, тем меньше рабочее расстояние и поле зрения. На корпусе объектива обозначены его увеличивающая способность (х8, х20, х40, х90) и числовая апертура.
Числовая апертура отражает количество света, попадающего в линзу:
А = п sin и,
где А — числовая апертура линзы; п — показатель преломления среды, граничащей с линзой; и — половина отверстного угла а (рис. 2).
Окуляр 13 содержит глазную и собирательную линзы, которые увеличивают изображение, полученное при помощи объектива. На окулярах указано их увеличение (х5, х7, х10, х15). Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений окуляра и объектива: например, окуляр х10 и объектив х90 увеличивают объект в 900 раз. Важно получить не только увеличенное, но и четкое изображение исследуемого объекта. Четкость изображения зависит от разрешающей способности микроскопа, которую понимают как минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.
Разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры пользуемого света. Например, апертура объектива х40 составляет 0,65, конденсора — 1,0, использован зеленый свет с длиной волны 0,55 мкм, отсюда разрешающую способность вычисляют по формуле
а = λ/(А1+А2),
где а — минимальное расстояние между двумя точками; Я —длина волны; Ах — числовая апертура объектива; Л2 — числовая апертура конденсора.
Рис. 2. Схема хода лучей при разном значении угла а:
А — объект; О — объектив; и — половина отверстного угла
Следовательно, в приведенном примере а = 0,55/(0,65 + 1,0) = = 0,33 мкм, т. е. при этих условиях предел разрешения равен 0,33 мкм.
Повысить разрешающую способность микроскопа можно за счет применения более коротких лучей света или, что более доступно, за счет приближения показателя преломления среды, граничащей с линзой, к аналогичному показателю стекла. С этой целью прослойку воздуха между линзой объектива и предметным стеклом замещают специальной жидкостью с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. Особенно это необходимо при использовании объективов большого увеличения (х 90 и больше) с фронтальными линзами малой площади. Показатель преломления стекла и воздуха составляет соответственно 1,52 и 1,0, поэтому в качестве иммерсионных жидкостей, создающих оптически однородную среду между предметным стеклом и линзой объектива, применяют чаще всего кедровое масло (л= 1,5), глицерин («= 1,4), воду («= 1,3). Ход лучей света при использовании обычного (сухого) и иммерсионного объективов показан на рисунке 3. Объективы для масляной иммерсии обозначают МИ, водной — ВИ.
Если апертура конденсора меньше апертуры рабочего объектива, то из-за слабого потока света возможности линзы объектива задействованы не полностью. Если апертура объектива меньше, чем апертура конденсора, что характерно для объективов малого увеличения, то уменьшают диаметр отверстия ирисовой диафрагмы конденсора.
Микроскопы необходимо хранить под чехлами или колпаками для защиты от пыли. Для наружной очистки оптики применяют смоченные спиртом мягкие ткани, не оставляющие после себя волокон. Использование ксилола и бензина для этих целей может привести к расклеиванию линз.
При микроскопировании существенное значение имеет освещение исследуемого объекта. Освещение чаще устанавливают по методу Келлера.
Осветитель (желательно использовать стандартные осветители ОИ-7 и ОИ-19, содержащие микролампу с небольшой плотно скрученной спиралью, которую можно передвигать вдоль оси осветителя) располагают на расстоянии 30...40 см от микроскопа.
На предметный столик ставят препарат, в рабочее положение переводят объектив х8.
3. Конденсор поднимают до упора, полностью открывают ирисовую диафрагму.
Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти полностью закрывают диафрагму осветителя.
На зеркало помещают лист белой бумаги и, передвигая патрон осветителя, добиваются четкого изображения на бумаге нити накала лампы.
Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.
Используя объектив х 8, фокусируют объект в области светлого пятна.
Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.
Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.
10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.
В работе с учебными микроскопами освещение нередко устанавливают упрощенным способом. Приступая к работе с микроскопом, проверяют состояние конденсора: он должен быть поднят до уровня предметного столика, диафрагма открыта. Приподняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наименьшим увеличением (х8, х10); глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. Затем на исследуемый препарат наносят каплю кедрового масла (или его заменителя), помещают препарат на предметный столик, поворотом револьвера устанавливают иммерсионный объектив. (Чтобы избежать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует держать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометрического винта погружают в каплю иммерсионного масла и, наблюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до видимости препарата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.
В конце работы тубус приподнимают макровинтом, револьвер переводят в нейтральное положение, масло с линзы осторожно снимают мягкой хлопчатобумажной тканью. Микроскоп убирают в деревянный футляр или накрывают стеклянным колпаком (лучше из цветного стекла) для защиты от света.
Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные свойства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).
Чтобы исследовать под микроскопом живые нефиксированные неокрашенные микроорганизмы, используют особые оптические системы: фазово-контрастное устройство и темнопольный конденсор.
Фазово-контрастное устройство. Включает в себя: а) фазовую пластинку — расположенный в задней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверхность которого напылено кольцо из металлов (фазовое кольцо); б) кольцевую диафрагму — помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрачным кольцевидным участком.
Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе приблизительно на '/4 длины волны и дополнительно сдвигается еще на 'Д после прохождения через фазовую пластинку. Ход лучей в фазово-контрастном устройстве показан на рисунках 4, 5. Сдвинутые по фазе после прохождения через фазовую пластинку лучи либо совпадают и складываются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противофазе. В первом случае исследуемый объект виден как светлый на темном фоне, а во втором — как темный на светлом фоне. В микробиологии широко применяют фазово-контрастное устройство КФ-4 (рис. 6) (объект виден темным на светлом фоне). Далее приведена последовательность перехода к работе с фазово-контрастным устройством.
Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив х40 — на аналогичный фазовый объектив.
Диск револьвера конденсора поворачивают до появления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора полностью открывают.
Используя объектив х8, устанавливают освещение по Келлеру.
Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помощью тубуса добиваются четкого изображения фазовой пластинки в виде темного кольца.
5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую объективу х40. В этом случае наряду с темным кольцом фазовой пластинки можно видеть светлое кольцо диафрагмы.
При помощи центрировочных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.
Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроскопируют препарат. При работе с другими объективами устанавливают соответствующие диафрагмы.
Темнопольный конденсор. При темнопольной микроскопии используют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта идут только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсора. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит темным (рис. 7). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.
Чтобы перейти к методу темнопольной микроскопии, поступают следующим образом.
Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчивают один из объективов (х 8).
Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить накала лампы на листе белой бумаги, помещенном на зеркале (см. п. 5 Установки освещения по Келлеру).
Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равномерного освещения поля зрения.
Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный конденсор, положение зеркала при этом не меняют.
На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с нижней поверхностью предметного стекла.
Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.
Люминесцентный микроскоп {lumen — свет, escennt — слабое действие). Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены люминесцентными микроскопами серии МЛ (рис. 8) и новой серии «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследовательского типа).
Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люминогены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильны низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо-, рентгенолюминесценцию.
В лабораторной практике в основном используют фотолюминесценцию—свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковременную—флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресценцию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света возбуждения большей длиной волны, поэтому при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хорошо видимые простым глазом.
Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. В микробиологии чаще применяют вторичную люминесценцию: обрабатывают биологический объект (препарат) специальными красителями — флуорохромами (акридин оранжевый, аурамин, флуоресцеин, уранин, родамин и др.), которые обладают интенсивной первичной люминесценцией. Флуорохромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при освещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами/В люминесцентных микроскопах источником возбуждения люминесценции служит ртутно-кварцевая лампа ДРШ-250. Чтобы провести успешную люминесцентную микроскопию: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделяют коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и отсекают лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят светофильтры типов УФС-3, ФС-1, СС-4 и др., которые называют «возбуждающими» светофильтрами; 2) из светового потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропускают длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно защищают глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя помещают окулярные (запирающие) светофильтры типов ЖС-3, ЖС-18, Т-1Н и Т-2Н.
Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскопа фильтров целевого назначения (возбуждающие, запирающие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещенных светофильтров обеспечивает цветную флуоресценцию объектов на темном фоне поля зрения (зелено-желтую).
Ход лучей в люминесцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРШ попадают на светоделительную пластинку, расположенную между объективом и окуляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светоделительную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинноволновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпевших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону источника света —лампы ДРШ. Такое дифференцирующее свойство светоделительной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоями диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к падающим на нее лучам.
Существенное отличие серии «Люмам» от МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разными параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесценции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильтрами и фильтрами возбуждающего света.
При люминесцентной микроскопии в качестве иммерсионной жидкости используют специальное нефлуоресцирующее масло (обычное иммерсионное масло для этих целей непригодно из-за собственной люминесценции).
Преимущество люминесцентной микроскопии заключается в том, что она дает цветное изображение, высокую степень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах. В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флуорохромированных объектов и метод флуоресцирующих антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.
Электронный микроскоп. Длина волн видимой области спектра лежит в пределах 0,4...0,7 мкм, следовательно, максимальное разрешение (половина длины волны), которое можно получить при помощи светового микроскопа, — около 0,2 мкм (200 нм). Волновые свойства также присущи электронам. При напряжениях 50 ООО... 100 ООО В длина волны электрона составит 0,0055... 0,0039 нм. По чисто техническим причинам получить теоретически максимальное разрешение, равное 0,002 нм, невозможно, и на практике оно не превышает 1...2 нм.
Основная часть электронного микроскопа включает в себя ряд магнитных линз, люминесцентный экран и фотографическую пластинку (рис. 10). Электрический ток проходит через вольфрамовую нить и вызывает эмиссию электронов. К нити приложено высокое отрицательное напряжение, что обеспечивает большую разницу потенциалов между нитью и заземленной пластиной анода. В этом поле электроны движутся к аноду, часть из них проходит через отверстие в центре анода (центральная апертура) и формирует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освещает объект. Большая часть электронов проходит через объект без отклонения, часть электронов после столкновения с тяжелыми атомами выбивается из общего электронного луча. В итоге образуется такая структура электронного луча, которая при дополнительной фокусировке дает изображение
объекта. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной магнитной линзой, которая дает увеличенное изображение; третья магнитная линза (проекционная), в свою очередь, также увеличивает изображение, которое и попадает на экран. Если люминесцентный экран убрать, то луч попадает на фотопластинку.
Электронный микроскоп, создающий изображение при прохождении электронов через тонкопленочный образец, называют трансмиссионным или просвечивающим.
В сканирующем электронном микроскопе первичный электронный луч, попадая на поверхность фиксированного, высушенного и покрытого тонким слоем металла объекта, вызывает различные вторичные излучения, интенсивность которых зависит от характеристик рельефа, электропроводности и химического состава. Полезное увеличение сканирующей электронной микроскопии обычно не превышает 50 000 раз. С ее помощью получают трехмерное изображение объекта (рис. 11).
Основные формы бактерий. Форма бактерий различных таксономических групп разнообразна (рис. 12), и ее обязательно учитывают при идентификации микроорганизма.
Кокки. Это бактерии шаровидной формы. В зависимости от взаимного расположения клеток различают микрококки— отдельно лежащие кокки, диплококки — парно расположенные кокки, стрептококки — цепочки кокков, стафилококки— скопление кокков в виде виноградной грозди, тетракокки — структуры из четырех кокков, сарцины — многослойные структуры из 8... 16 кокков.
Палочковидные бактерии. Клетки цилиндрической формы, могут располагаться одиночно, парами — диплобактерии, Цепочками — стрептобактериИ. Палочковидные бакте рии, образующие в неблагоприятных условиях специфическую форму существования — спору, диаметр которой не превышает диаметр клетки (аэробные палочковидные бактерии), называют бациллами. Если диаметр споры в клетке существенно превышает ее поперечный диаметр, то такие спорообразующие бактерии называют клостридиями (анаэробные палочки).
Извитые (спиралевидные) бактерии. К ним относят вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы — клетки в форме слегка изогнутых палочек; спириллы — бактерии, образующие до 6 завитков; спирохеты — бактерии со множеством (свыше 6) мелких завитков и в отличие от спирилл без жгутиков.
Ветвящиеся бактерии. Выраженная способность к ветвлению отмечена у прокариот из группы актиномицет; тенденцию к ветвлению на отдельных стадиях развития проявляют и другие бактерии, например микобактерии.
Бактерии без постоянной формы. Микоплазмы лишены клеточной стенки, поэтому их форма легко изменяется.
У большинства бактериальных клеток нет дифференциации на передний и задний концы, нижнюю и верхнюю стороны, т. е. функционально они равноценны, хотя есть исключения.
Полиморфизм. Это свойство некоторых видов бактерий в процессе роста на питательных средах образовывать формы, отличающиеся от типичной.
Определение размеров микроорганизмов. Размеры бактерий варьируют в широких пределах — от 0,2 мкм (микоплазмы) до 125 мкм {Ochromotium oxaliferum). Размеры большинства патогенных бактерий составляют от нескольких десятых микрометра до нескольких микрометров.
При характеристике размеров бактерий обычно указывают длину и ширину клетки в микрометрах (10~3мм). В качестве инструментов измерения используют окуляр- и объект-микрометры..
Окуляр-микрометр. Это стеклянная пластинка, на которой линия в 5 мм разделена на 10 или 20 делений (размещают в окуляре).
Объект-микрометр. Представляет собой предметное стекло с линией длиной 0,5 или 1,0 мм, разделенной на сотые доли (рис. 13, 14).
Объект-микрометр помещают на предметный столик и, глядя в окуляр с окуляр-микрометром, совмещают начальную черту в объект- и окуляр-микрометрах. Затем определяют цену деления окуляр-микрометра при данных окуляре и объективе. Например: шкала объект-микрометра составляет 1 мм и одно ее деление равно 10-2 мм, т.е. 10мкм.
При совмещении шкалы объект-микрометра три его деления (т. е. 30 мкм) соответствуют 14 делениям окуляр-микрометра, отсюда одно деление окуляр-микрометра составляет 30: 14 = 2,14 мкм. После того как определена цена одного деления окуляр-микрометра, вместо объект-микрометра помещают препарат с исследуемым объектом. Например, палочковидный микроб по длине занимает 3, а по ширине — 0,5 деления окуляр-микрометра. Если одно деление окуляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки будет 3-2 = 6 мкм, а ширина — 0,5 • 2 = 1 мкм.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Ознакомиться с бактериологической лабораторией, ее основным оборудованием, правилами техники безопасности.
Изучить устройство светового микроскопа, установку освещения по Келлеру, принципы фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной и электронной микроскопии.
3. Освоить приемы работы с иммерсионным объективом микроскопа.
Провести микроскопию препаратов с бактериями различной формы.
Определить размеры бактериальных клеток.
Контрольные вопросы
1. Каковы основные правила работы в бактериальной лаборатории?
2. Как проходят лучи в иммерсионной системе, фазово-контрастном устройстве микроскопа, темнопольном конденсоре, люминесцентном микроскопе?
3. Каковы основные формы бактерий?
4. Как определяют размеры микроорганизмов?
Тема 2
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ
Цель занятия. Ознакомить студентов с основными бактериологическими красителями, техникой их приготовления и методом простой окраски бактериальных препаратов.
Оборудование и материалы. Набор сухих бактериологических красок и их растворов, культуры бактерий на МПА и в МПБ (Е. coli, S. aureus), световые микроскопы, обезжиренные предметные стекла, фуксин Пфейффера, красящие бумажки по Синеву, раствор метиленового синего, фильтровальная бумага для высушивания мазков, физиологический раствор.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Обычно форму, взаимное расположение, некоторые особенности химического состава и строения бактериальных клеток определяют путем микроскопии окрашенных препаратов. Оптическая плотность неокрашенных бактерий близка к оптической плотности стекла, поэтому бактерии плохо различимы при микроскопиро-вании. Окрашенные клетки, наоборот, четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя.
Отношение к различным красителям и методам окраски называют тинкториальными свойствами микроорганизмов.
Бактериологические красители. Для окрашивания бактериальных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимодействующие с красителем, преимущественно отрицательно заряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.
Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения готовят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдерживают в термостате для лучшего растворения веществ, затем фильтруют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нерастворившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседают на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроскопом.
Далее приведены рецепты спиртовых растворов красок, наиболее часто применяемых в микробиологии.
Карболовый фуксин Циля: раствор А: основной фуксин —0,3 г, 96%-й этанол —10 мл; раствор Б: фенол — 5 г, вода дистиллированная — 95 мл. Растворы А и Б смешивают.
Фуксин Пфейффера — это фуксин Циля, разведенный водой в соотношении 1: 10 (из-за нестойкости используют только в течение рабочего дня).
Карболовый кристаллический фиолетовый: раствор А: кристаллический фиолетовый — 0,4 г, 96%-й этанол — 10 мл; раствор Б: фенол — 1 г, вода дистиллированная — 100 мл. Растворы А и Б смешивают.
Водные растворы. Так как эти растворы красителей нестойкие, их готовят непосредственно перед использованием (ex tempore).
Раствор сафранина: сафранин — 2 г, вода дистиллированная горячая (/= 90 °С) — 100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор малахитового (бриллиантового) зеленого: малахитовый зеленый — 1 г, вода дистиллированная горячая —100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор Люголя — стойкий раствор используют для окраски по методу Грама: йод кристаллический — 1 г, йодид калия—2 г, вода дистиллированная — 10 мл. Смесь выдерживают 24 ч при 37 °С, после чего добавляют дистиллированную воду до 300 мл и одну-две капли глицерина.
Приготовление бактериальных препаратов для световой микроскопии. Приготовление окрашенных бактериальных препаратов включает в себя приготовление мазка, его высушивание, фиксацию и окрашивание. Материалом для исследования служат культуры бактерий на плотных или жидких питательных средах или нативный материал: органы, ткани, воспалительный экссудат и т. д. Препараты готовят на чистых, обезжиренных предметных стеклах.
На предметное стекло наносят исследуемый материал. Если материал жидкий и находится в бактериологической пробирке (бульонная культура), то пробирку берут в левую руку, в правую — бактериологическую петлю (как пишущее перо), прожигают ее в пламени горелки, мизинцем правой руки захватывают пробку и над пламенем горелки извлекают ее из пробирки, края пробирки обжигают. Петлей, не смачивая петледержатель, берут материал и распределяют на предметном стекле по площади размером 2 см2. Края пробирки вновь обжигают, закрывают ее пробкой, обжигают бактериологическую петлю.
Аналогичным образом готовят мазок из агаровой культуры, осторожно захватывая петлей бактериальную массу с поверхности питательной среды. На предметное стекло в этом случае предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора, в котором петлей суспендируют бактериальную массу.
Из животных тканей готовят мазки-отпечатки: стерильно вырезают кусочек органа, поверхностью среза несколько раз касаются поверхности предметного стекла.
Приготовленный мазок высушивают на воздухе.
Мазок фиксируют для прикрепления бактериальных клеток к поверхности стекла и их инактивации. Применяют физический и химический способы фиксации. При физическом способе препарат обратной стороной стекла два-три раза ме д ленно проводят над пламенем горелки. Чрезмерное нагревание вызывает изменение формы клетки и ее тинкториальных свойств. При химическом способе на предметное стекло с мазком наносят одну из следующих жидкостей: 96%-й этанол — на 10 мин; ацетон — на 5 мин; смесь этанола и эфира (соотношение 1: 1) — на 10...15 мин.
Фиксированный препарат окрашивают одним из методов.
Раствор краски смывают дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.
Процедуру окрашивания препарата проводят на «мостике» (параллельные стеклянные трубки) над сливной чашкой.
Простые методы окраски бактерий. При этом способе окрашивания используют один краситель: например, на мазок наносят фуксин Пфейффера на 2...3 мин или метиленовый синий Леффлера на 3...10 мин. В таком препарате можно определять форму клеток, их взаимное расположение.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур, окрасить одним из красителей простым методом.
Контрольные вопросы
1. Какие бактериологические красители наиболее часто применяют в лабораторной практике?
2. Как их готовят?
Тема 3
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ: ОКРАСКА ПО МЕТОДАМ ГРАМА И ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА
Цель занятия. Ознакомить студентов со сложными методами окраски, с помощью которых дифференцируют грациликутные, фирмикутные и кислотоустойчивые бактерии.
Оборудование и материалы. Смесь культур Е. соli иS. aureus, смесь Е. coli, S. aureus и микобактерий (вакцина БЦЖ), красители для окраски бактерий по методам Грама и Циля-Нильсена, световые микроскопы, бактериологические петли, 96%-й этанол, фильтровальная бумага, предметные обезжиренные стекла, 5%-й раствор серной кислоты, дистиллированная вода.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
При сложных методах окраски используют несколько различных красителей, что позволяет выявить особенности строения и химического состава клетки.
Окраска бактерий по методу Грама. Это один из наиболее распространенных сложных методов окраски, основан на различиях в строении и химическом составе клеточной стенки. В зависимости от результатов окрашивания все бактерии подразделяют на грамположительные и грамотрицательные.
При окрашивании генциановый фиолетовый в присутствии йода образует комплекс с компонентами клеточной стенки. У грамположительных прокариот клеточная стенка при обработке этанолом удерживает образовавшийся комплекс и бактерии окрашены в фиолетовый цвет; у грамотрицательных этанол вымывает этот комплекс и после дополнительного окрашивания препарата фуксином клетки приобретают красный цвет.
Этапы окраски. На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генциан кристалл- или метилвиолета (бумажки по Синеву), наносят на нее несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживают 1...2мин, бумажку удаляют. Препарат, не промывая, обрабатывают раствором Люголя 1...2мин; раствор сливают. Затем наносят 96%-й этанол на 30...45 с, после чего препарат тщательно промывают водой и окрашивают фуксином Пфейффера 1...2мин. Вновь промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Микроскопическая картина: бактерии, окрашенные в темно-фиолетовый цвет, относят к грамположительным, или фирмикутам, в красный цвет — к грамотрицательным, или грациликутам.
Основная сложность окраски по методу Грама — опасность переобесцвечивания препарата этанолом.
Чтобы избежать переобесцвечивания, разработан ряд модификаций, например модификация Хукера.
Модификация Хукера. Готовят следующие красители: раствор А- кристаллвиолет — 2 г, 96%-й этанол — 20 мл; раствор Б: окса-лат аммония — 0,8 г; дистиллированная вода — 80 мл. Растворы А и Б смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Раствор В: 2,5%-й раствор сафранина (в 96%-м этаноле) — 10 мл, дистиллированная вода — 100 мл.
Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь растворов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают. Наносят 96%-й этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и окрашивают раствором В 10 с, промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
Окраска бактерий по методу Циля-Нильсена. Кислотоустойчивые бактерии — грамположительные, однако повышенное содержание в клеточной стенке липидов и миколовой кислоты придает клетке гидрофобные свойства, затрудняющие проникновение в нее красителя и усиливающие ее устойчивость к воздействию растворов кислот. Исходя из этих особенностей был разработан метод, с помощью которого выявляют кислотоустойчивые виды.
Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумажку (1 см2) карболовым фуксином Циля с подогреванием до появления паров; оставляют на «мостике» до остывания, повторяют нагрев. Общая экспозиция З...7мин. Бумажку удаляют, краску сливают, на препарат, не промывая водой, наносят 3...5%-й раствор серной кислоты на 5...7 с. Затем препарат промывают водой и окрашивают раствором метиленовой сини Леф-флера 4...5 мин, после чего промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: кислота не обесцветила кислотоустойчивые бактерии, и они окрашены в красный цвет; некислотоустойчивые бактерии восприняли дополнительный синий краситель.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Из культур Е. coli и S. aureus приготовить мазки, окрасить по методу Грама, промикроскопировать и зарисовать.
Приготовить из смеси микобактерий (БЦЖ), Е. coli, S. aureus мазки, окрасить по методу Циля-Нильсена, промикроскопировать и зарисовать.
Контрольные вопросы
1. Чем обусловлены тинкториальные особенности грамположительных и грамотрицательных бактерий?
2. На каких особенностях кислотоустойчивых бактерий основан метод окраски по Цилю-Нильсену.
Тема 4
ОКРАСКА БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР, КАПСУЛ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ЖГУТИКОВ. МЕТОД ПРЯМОГО ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ
Цель занятия. Ознакомить студентов с методами обнаружения у бактерий спор, капсул, жгутиков, цитоплазматических включений методом прямого флуорохромирования бактерий.
Оборудование и материалы. 24-часовая культура P. multocida на сывороточном МПА, культура В. cereus на МПА на стадии спорообразования; сенной настой, красители, предметные и покровные стекла, световые микроскопы.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Выявление бактериальных спор. Спора - особая форма существования грамположительных бактерий, формируется эндогенно, характеризуется специфическими структурами (многослойные белковые покровы, наружная и внутренняя мембраны, кортекс) и повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды.
Споры с большим трудом воспринимают красители, но прочно удерживают их после окраски (рис. 15)
На этой особенности спор основаны все методы их выявления. Для окрашивания спор применяют красители с протравителями (карболовый фуксин и др.) и подогревание, чтобы увеличить проницаемость оболочки. Для разрыхления оболочки иногда перед окраской препараты обрабатывают хромовой или другими неорганическими кислотами.
Метод Мёллера. Фиксированный мазок обрабатывают 5%-м раствором хромовой кислоты при легком подогревании 10 мин, промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой. Затем на фильтровальную бумагу (1 см2), помещенную на мазок, наносят карболовый фуксин и подогревают до появления паров, дают остыть, повторяют нагревание два-три раза. Общая экспозиция окрашивания карболовым фуксином 7 мин (мазок должен быть влажным). Бумажку с краской сбрасывают бактериальной петлей; не промывая водой, мазок обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты 5...7 с, после чего тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим 3 мин. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: споры окрашены в розово-красный цвет, вегетативные клетки — в синий.
Метод Вальдмана..На фиксированный мазок наносят щелочную синьку Леффлера и нагревают до кипения, дают остыть и промывают водой. Докрашивают 1%-м водным раствором нейт-ральрота 30 с, промывают водой, подсушивают.
Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым синим с подогреванием до закипания, затем промывают водой и докрашивают 1%-м водным раствором нейтральрота 10 с. Препарат промывают водой, подсушивают.
Метод Ауески. Нефиксированный мазок обрабатывают 0,5%-м раствором соляной кислоты 2...3 мин при подогревании, затем промывают водой и фиксируют над пламенем. Окрашивают карболовым фуксином Циля при подогревании 7...8 мин. Краску сливают и препарат обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты 5...7 мин, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 4...5 мин, после чего вновь промывают водой и подсушивают.
Микроскопическая картина: споры красные, вегетативные клетки синие.
Метод Шеффера-Фултона. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-й водный раствор малахитовой зелени и выдерживают 5 мин над кипящей водой, после чего промывают водой и окрашивают 2%-м водным раствором сафранина 30 с. Препарат промывают водой, подсушивают.
Микроскопическая картина: споры зеленые, вегетативные клетки красно-коричневые.
Выявление капсул бактерий. Капсула — это слизистое образование, обволакивающее клетку и сохраняющее связь с клеточной стенкой. У большинства прокариот капсула построена из полисахаридов гомо- или гетерополимерной природы. У некоторых видов бактерий капсула содержит полипептид — полимер D-тяута-миновой кислоты. Вещество капсулы обычно воспринимает красители слабее, чем другие клеточные компоненты, поэтому при специальных методах окраски можно дифференцировать капсулу от остальных структур. Многие виды патогенных бактерий образуют капсулу, которая выполняет защитную функцию в основном за счет снижения эффективности фагоцитоза (рис. 16).
Метод Михина. Препарат окрашивают щелочной синькой Леффлера с подогреванием до появления паров и затем выдерживают еще 5...6 мин (мазок должен быть влажным). Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Обычно используют старые растворы красителя, так как у них больше выражена способность к метахроматической окраске.
Микроскопическая картина: капсула розовая, клетки синие.
Метод Ольта. Фиксированный мазок окрашивают при подогревании 2%-м водным раствором сафранина, приготовленным ex tempore. Экспозиция окрашивания 1...2мин. Затем промывают водой, подсушивают. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом.
В мазках-отпечатках из тканей больного животного капсулированные клетки легко обнаружить благодаря контрастирующему фону, который образован плазмой и тканевыми элементами. Для имитации подобного фона при выявлении капсул у клеток бактериальных культур разработаны специальные методы окраски.
Метод Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови животного любого вида, петлей вносят в нее и суспендируют изучаемую культуру. Суспензию распределяют равномерным тонким слоем по поверхности стекла. Препарат фиксируют на пламени и окрашивают 0,1%-м водным раствором кристаллвиолета 1 мин. Мазок промывают 20%-м водным раствором сульфата меди, подсушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: капсула бледно-голубая, клетка темно-фиолетовая, фон фиолетовый.
Метод Гинса. На край предметного стекла помещают каплю черной туши, предварительно разведенной дистиллированной водой в соотношении 1: 3 и центрифугированной при 3000 мин-1 15 мин. В капле туши петлей суспендируют бактериальную массу. Вторым предметным стеклом суспензию равномерно распределяют по поверхности стекла, т. е. мазок готовят так же, как мазки из капли крови. Мазок высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным дистиллированной водой в соотношении 1:3. Экспозиция окрашивания 4...5 мин. Препарат промывают водой и подсушивают.
Микроскопическая картина: капсула видна как светлый или розовый ободок вокруг темно-красных клеток бактерий, общий фон за счет туши черный.
Выявление цитоплазматических включений. При идентификации прокариот имеет значение обнаружение в их цитоплазме скоплений определенных химических веществ (включений): полифосфатов — волютина (метахроматина), полисахаридов — глюканов, состоящих из Д-глюкозы и некоторых других соединений.
На фиксированный препарат наливают смесь растворов А и Б в соотношении 2: 1 на 1 мин, краску сливают. Мазок, не промывая, обрабатывают раствором В 1 мин и промывают водой. Затем на препарат наносят раствор Г на 2...3 мин, промывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: клетки светло-желтые, зерна волютина темно-синие.
Обнаружение поли-β-оксимасляной кислоты. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 0,3%-м раствором Судана черного «В» в этиленгликоле 5... 15 мин. Краску сливают и препарат, не промывая, подсушивают на воздухе, затем ополаскивают в ксилоле, высушивают и погружают в 0,5%-й водный раствор сафранина на 5...10 с, промывают водой, подсушивают.
Микроскопическая картина: включения видны на розовом фоне в виде черно-синих зерен.
Обнаружение полисахаридов. На фиксированный препарат на- • носят 1%-й спиртовой раствор алцианового синего на 1 мин (краситель перед использованием разводят водой в соотношении 1:8). Препарат промывают водой, подсушивают, затем обрабатывают карболовым фуксином Циля и сразу же промывают водой, подсушивают.
Микроскопическая картина: цитоплазма красного цвета, по-лисахаридные включения — голубого.
Методы обнаружения жгутиков у бактерий. Жгутики — структуры нитевидной формы, белковой природы, определяют способность клетки к движению в жидкой среде (рис. 17). Количество и характер расположения жгутиков у бактерий различны. У монотрихов один-два жгутика расположены на одном из полюсов клетки (Pseudomonas); у лофотрихов пучок жгутиков расположен полярно или субполярно (Spirillum); у амфитрихов жгутики —на обоих полюсах клетки; у перитрихов — по всей поверхности клетки (Enterobacteriaceae).
Монотрихи двигаются прямолинейно и поступательно, при необходимости могут изменить направление движения на 180° (клетка переворачивается); движение лофотрихов прямолинейное вперед или назад; перитрихи передвигаются хаотично (рис. 18).
Жгутики легко повредить, поэтому препараты готовят с большой осторожностью. Стекла используют чисто вымытые, без царапин. Исследуемая культура должна быть не старше 12...18 ч. Бактериальную массу осторожно вносят в пробирку с несколькими миллилитрами физиологического раствора. Суспензию выдерживают 15...20 мин в термостате, затем петлей каплю жидкости из пробирки осторожно переносят на предметное стекло, высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают одним из специальных методов.
Метод серебрения по Морозову. Готовят четыре раствора. Раствор А: вода дистиллированная — 100 мл, 40%-й раствор формалина — 2 мл, ледяная уксусная кислота — 1 мл. Раствор Б: танин — 5 г, жидкая карболовая кислота — 1 мл, вода дистиллированная — 100 мл. Раствор В: нитрат серебра —5 г, дистиллиро ванная вода — 100 мл. К 80 мл этого раствора по каплям добавляют аммиак до растворения осадка и образования легкой опалес-ценции. Для окраски раствор серебра разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 10.
На препарат наносят раствор А на 1 мин, затем раствор сливают и препарат промывают водой, обрабатывают раствором Б и подогревают 1 мин до отхождения паров, промывают водой, после чего наносят раствор В и подогревают 1...2мин до появления темно-коричневой окраски мазка, промывают водой, подсушивают.
Микроскопическая картина: тела бактерий угольно-черного цвета, жгутики в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом однородном фоне.
В повседневной бактериологической работе чаще используют косвенные методы обнаружения жгутиков — выявляют подвижность клеток исследуемой бактериальной культуры.
Препарат «раздавленная капля». На чистое обезжиренное предметное стекло пастеровской пипеткой наносят одну-две капли 18...20-часовой бульонной культуры, накрывают чистым покровным стеклом. Количество жидкости должно быть достаточным для заполнения всего пространства под покровным стеклом. Микроскопируют с объективом х 40 или х 90. Неокрашенные бактерии лучше видны при легком затемнении поля зрения, поэтому конденсор целесообразно опустить на 5... 10 мм ниже плоскости предметного столика. Клетки видны в виде светлых или серых «теней», при объективе х 90 четко видны только клетки, передвигающиеся в горизонтальной плоскости; бактерии, двигающиеся вертикально, быстро уходят из зоны четкого изображения.
Препарат «висячая капля». Каплю исследуемой культуры бактериологической петлей наносят на чистое покровное стекло. Берут специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре, края лунки смазывают вазелином, стекло переворачивают лункой вниз и прижимают к покровному таким образом, чтобы капля с бактериями была в центре лунки. Затем предметное стекло резко переворачивают, и капля зависает под покровным стеклом в лунке. При микроскопии бактериальные клетки легче обнаружить по краю капли, где слой жидкости тоньше.
Активное движение бактерий необходимо дифференцировать от броуновского — колебаний клетки под ударами молекул воды и пассивного движения всех клеток с током жидкости в одну сторону при наличии уклона.
Помимо перечисленных методов для выявления жгутиков нередко прибегают к посеву исследуемой культуры уколом в полужидкий агар (см. тему 8). Подвижные бактерии растут по всей питательной среде в пробирке, неподвижные — только по уколу.
Метод прямого флуорохромирования бактерий. Для обнаружения некоторых видов бактерий и их отдельных структур препараты обрабатывают флуорохромами с последующим изучением в люминесцентном микроскопе. Наиболее широко этот метод применяют для выявления возбудителя туберкулеза.
Мазки из исследуемого материала готовят, как для обычной микроскопии, фиксируют раствором А; окрашивают раствором Б 15 мин, промывают водой, затем обрабатывают раствором В 5 мин, промывают водой, наносят раствор Г на 2 мин, после чего препарат промывают водой и подсушивают.
Микроскопическая картина: при объективе х40 туберкулезные бактерии видны в виде золотистых черточек; под объективом х 90 (иммерсионным) на темном фоне обнаруживают светящиеся золотисто-зеленые палочки возбудителя.
Демонстративен способ выявления спор бактерий при окрашивании бриллиант-сульфофлавином, трипафлавином.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Приготовить, окрасить и промикроскопировать препарат бактерий со спорами (В. cereus).
Окрасить одним из способов капсулы P. multocida и промикроскопировать.
Приготовить препарат «раздавленная капля» из сенного настоя, обнаружить методом микроскопии подвижные клетки бактерий.
Контрольные вопросы
На каких тинкториальных особенностях спор и капсул основаны методы их окраски?
Какие прямые и косвенные методы применяют для обнаружения бактериальных жгутиков?
Какое значение имеет выявление цитоплазматических включений для идентификации прокариот?
Тема 5
МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ
Цель занятия. Ознакомить студентов с особенностями морфологии и методами исследования микроскопических грибов различных таксономических групп.
Оборудование и материалы. Грибные культуры родов Мисог, Penicillium, Aspergillus, Fusarium на плотных средах в чашках Петри, суспензия дрожжей в бактериологических пробирках, предметные и покровные стекла, микологические крючки или препаровальные иглы, световой микроскоп.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Грибы — это хемоорганотрофные микроорганизмы с эукариотической клеточной организацией, лишены фотосинтетических пигментов, широко распространены в природе. Грибы относят к царству Fungi (лат.) или Mycota (греч.), включающему в себя около 120 000 видов. Для ветеринарии наибольшее значение имеют микроскопические грибы, вызывающие патологию у животных и людей, — представители родов Aspergillus, Penicillium, Мисог, Fusarium, Candida, Histoplasma, Coccidioides, Stachybotrys, Dendrodochium.
Морфология грибов. У большинства видов вегетативное тело (таллом) состоит из ветвящихся нитевидных клеток (гифов), образующих мицелий, или грибницу. Нитевидные грибы (гифомицеты) условно называют плесневыми. Существуют и одноклеточные неветвящиеся грибы — дрожжи, дрожжеподобные (рис. 19).
Различают мицелий субстратный, контактирующий с питательной средой, и воздушный, возвышающийся над нею. Попадая в субстрат, гифы растут концевыми участками и ветвятся радиально от центра инокуляции к периферии, формируя колонию. Для прикрепления к субстрату и потребления из него питательных веществ мицелий у некоторых видов образует корешкообразные выросты — ризоиды. К видоизменениям мицелия относят также склероции — округлые или продолговатые сплетения гифов, содержащие много питательных веществ, необходимых грибу при неблагоприятных условиях (рис. 20).
По строению мицелия грибы подразделяют на два класса.
Низшие грибы (фикомицеты). Этот класс характеризуется несептированным мицелием, который представлен одной сильно разветвленной гигантской клеткой без перегородок и с многочисленными ядрами.
Высшие грибы (микомицеты). Характеризуются септированным мицелием: гифы мицелия разделены перегородками (септы,септумы) на отдельные одноядерные или многоядерные клетки. Цитоплазма одной клетки сообщается с цитоплазмой соседней через пору в центре перегородки. У некоторых высших грибов (дрожжи) мицелий отсутствует, а вегетативное тело представлено отдельными клетками с клеточной стенкой. Если в процессе деления или почкования дрожжевые клетки не расходятся, то образуются скопления клеток, которые называют ложным мицелием (псевдомицелием) (см. рис. 19).
Размножение грибов. Различают вегетативный и репродуктивный способы размножения.