АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

И ИММУНОЛОГИИ

Попущено Министерством сельского хозяйства Рос­сийской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений по специальнос­ти 310800 «Ветеринария»

Ф

МОСКВА «КОЛОС» 2001

Редактор В. В. Ракитская

Рецензент профессор П. Ф. Сонин (С.-Петербургская государственная акаде­мия ветеринарной медицины)

Костенко Т. С., Родионова В. Б., Скородумов Д. И. Практикум ветеринарной микробиологии и иммунологии. — М.: Колос, 2001. — 344 с: ил. — (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений). ISBN 5-10-003507-2.

Изложены методы бактериологических и серологических исследований, приведены схемы лабораторной диагностики бактериозов и микозов сельс­кохозяйственных животных.

Каждая тема содержит методические указания, перечень материалов, необходимых для проведения занятия, задания для самостоятельной работы и контрольные вопросы для самопроверки.

Практикум может быть полезен при проведении факультативных занятий. -

Для студентов вузов по специальности «Ветеринария».

УДК 616.9:619(076.5)

ББК 48.73я73

ISBN 5-10-003507—2

Раздел I

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

•

Тема 1

ВЕТЕРИНАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ. ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия. Ознакомить студентов с назначением бактерио­логической лаборатории, ее основным оборудованием и прави­лами техники безопасности; с принципами фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной, электронной микроскопии. Освоить микроскопическое исследование бактериальных препа­ратов с применением иммерсионной системы. Изучить основ­ные формы бактерий и методику определения их размеров.

Оборудование и материалы. Термостаты, микроанаэростаты, холодильники, сушильные шкафы, автоклавы, центрифуги, ваку­умные насосы, дистиллятор, водяные бани, потенциометр (рН-метр), фильтры, лабораторная посуда, световой, люминесцент­ный и электронный микроскопы, темнопольный конденсор, фазово-контрастное устройство, окуляр- и объект-микрометры, го­товые препараты с бактериями, иммерсионное масло.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Ветеринарно-бактериологическая лаборатория. Это учреждение Государственной ветеринарной службы РФ. Различают район­ные, межрайонные, областные (краевые) и республиканские ла­боратории. В их задачи входят: проведение бактериологических, серологических, вирусологических, микологических, биохими­ческих, патологоанатомических и других исследований для уста­новления лабораторного диагноза болезней животных всех ви­дов, проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лаборатории размещают в специальном здании с дифферен­циацией на отделы. Например, для межрайонных и районных ветеринарных лабораторий предусмотрены бактериологический, серологический и химико-токсикологический отделы. Выделяют помещение для вивария, где содержат экспериментальных жи­вотных (мыши, морские свинки, кролики и т. д.), а также баранакак донора крови, необходимой для приготовления питательных сред и постановки серологических реакций (РСК). Зараженных и здоровых животных содержат в разных комнатах вивария.

В бактериологической лаборатории оборудуют боксы. Под них отводят отгороженную стеклянной переборкой часть помещения или две-три смежные комнаты. В боксе работают, когда необхо­димо предотвратить контаминацию (загрязнение) окружающей среды патогенными микроорганизмами или исследуемых культур посторонней микрофлорой. Перед работой воздух и стенки бокса обеззараживают ультрафиолетовыми лучами бактерицидных ламп.

В отдельных помещениях лабораторного корпуса моют посу­ду, инструменты (моечная), готовят питательные среды (бакте­риологическая кухня), стерилизуют посуду, среды, спецодежду, обеззараживают культуры бактерий и инфекционный материал (автоклавная).

Правила техники безопасности в ветеринарно-бактериологической лаборатории. Работа в бактериологических лабораториях со­пряжена с опасностью заразиться самим или заразить других па­тогенными микроорганизмами. Для студентов ветеринарных ву­зов лабораторией служит кафедра микробиологии. Сотрудники бактериологических лабораторий и кафедры микробиологии, ас­пиранты, студенты, приходящие на занятия или для работы в на­учно-студенческих кружках, обязаны ознакомиться с правилами техники безопасности и строго их соблюдать.

Входить в помещение лаборатории и работать в ней разреша­ется только в специальной одежде — халате и головном уборе (шапочка, косынка). Халат должен быть застегнут, волосы подо­браны.

Не разрешается вносить посторонние предметы; личные вещи (портфели, сумки) оставляют в отведенных для этой цели местах.

Категорически запрещается курить и принимать пищу.

Перед началом работы проверяют исправность приборов (га­зовых и спиртовых горелок). О всех неисправностях сообщают ответственному лицу лаборатории, на учебных занятиях — пре­подавателю.

Не разрешается зажигать одну горелку от другой во избежание взрыва. Для зажигания горелок используют только спички.

Электроприборы включают с разрешения преподавателя или обслуживающего персонала кафедры. Запрещается касаться про­водов и контактных частей электросети.

Рабочее место и оборудование содержат в чистоте, соблюдают опрятность в работе.

Исследуемый материал должен рассматриваться как особо опасный. При работе с ним необходимо соблюдать принятые в микробиологической практике технические правила, исключаю­щие возможность заражения работника.

Движение культур микроорганизмов (посев, хранение, унич­тожение) регистрируют согласно действующей инструкции в специальном журнале.

В случае попадания материала или культур микроорганизмов на пол, стол и т. д. обрабатывают эти поверхности дезинфициру­ющим раствором.

После окончания работы использованный материал (патоло­гический материал, бактериальные, грибные культуры, инстру­менты и др.) студенты отдают преподавателю или лаборанту для обеззараживания, рабочее место тщательно убирают и дезинфи­цируют; моют и дезинфицируют руки, халаты и головные уборы складывают в полиэтиленовые пакеты.

После ознакомления с правилами техники безопасности на кафедре микробиологии студенты расписываются в журнале пре­подавателя.

Основное оборудование диагностических бактериологических ла­бораторий. Лаборатории в обязательном порядке оснащены сле­дующим оборудованием.

Термостат используют для культивирования микроорга­низмов в аэробных условиях. Это шкаф с двойными стенками, пространство между которыми заполнено водой или воздухом; снабжен устройством для поддержания постоянной температуры в диапазоне 28...43 °С (стабильную температуру лучше поддержи­вают водяные термостаты).

Микроанаэростаты необходимы для культивирова­ния клеток в анаэробных условиях (см. тему 7); представляют со­бой герметические емкости, из которых с помощью насоса уда­ляют воздух и затем помещают в термостат.

Печь Пастера и автоклав служат для стерилиза­ции инструментов, лабораторной посуды, питательных сред, спецодежды и т. д. Их устройство и принцип работы подробно изложены в теме 6.

Холодильники бытовые (4...6 °С) и низкотемператур­ные (-20 °С и ниже) используют для хранения питательных сред, культур микроорганизмов, вакцин, сывороток, поступившего для бактериологического исследования материала.

Центрифуги настольные, рефрижераторные (для разделения компонентов в условиях низких температур), микроцент­рифуги предназначены для осаждения микроорганизмов, отделе­ния форменных элементов от плазмы крови и др.

Помимо перечисленного оборудования в лаборатории необхо­димы: вакуумные насосы, дистиллятор, технические и аналити­ческие весы, водяные бани, потенциометр, керамические, асбес­товые и мембранные фильтры, аппараты для изготовления ватно-марлевых пробок, лабораторная посуда — чашки Петри, бак­териологические и серологические пробирки, пластиковые планшеты для культуральных работ и микротитрования, колбы, мерные цилиндры, матрацы, градуированные и пастеровские пи­петки, специальные инструменты — бактериологические петли, иглы, шприцы, пинцеты, шпатели, ножницы и т. д.

Техника микроскопирования. Микроскопы, дающие увеличе­ние в сотни (световой) или тысячи раз (электронный), использу­ют для изучения морфологии и строения микроорганизмов. Бак­териологические лаборатории снабжены микроскопами различ­ных типов: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др.

Световой микроскоп. Основные узлы световых микроскопов показаны на рисунке 1.

К механическим частям микроскопа относят штатив, состоя­щий из основания и тубу содержателя. К тубусодержателю 12 прикреплены: тубус 14, револьвер 18— вращающийся диск с гнездами для объективов и предметный столик 20 с клеммами 5, фиксирующими предметное стекло с изучаемым объектом. Тубус передвигают вверх-вниз при помощи макро- 2 и микрометричес­кого 1 винтов.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного ап­парата, зеркала, апертурной диафрагмы, конденсора, объективов и окуляров. Зеркало 23 подвижно закреплено под конденсором, одна его поверхность

плоская, другая — вогнутая. При работе с конденсором используют плоскую, без конденсора — вогнутую поверхность зеркала. Конденсор 21 применяют для концентри­рования отраженных зеркалом лучей света, фокус которых дол­жен находиться в плоскости препарата. Верхняя линза конденсо­ра плоско-выпуклая, нижняя — двояковыпуклая. Под конденсо­ром помещена апертурная (ирисовая) диафрагма 22. Изменяя диаметр отверстия, через которое проходит пучок света, регули­руют интенсивность освещения поля зрения.

Объективы 19 состоят из нескольких линз, заключенных в ме­таллическую оправу. Только одна линза — фронтальная — вы­полняет функцию увеличения, остальные предназначены для коррекции изображения. Под рабочим расстоянием объектива понимают расстояние от плоскости фронтальной линзы до изу­чаемого объекта при нахождении последнего в фокусе. Чем боль­ше увеличение объектива, тем меньше рабочее расстояние и поле зрения. На корпусе объектива обозначены его увеличивающая способность (х8, х20, х40, х90) и числовая апертура.

Числовая апертура отражает количество света, попадающего в линзу:

А = п sin и,

где А — числовая апертура линзы; п — показатель преломления среды, граничащей с линзой; и — половина отверстного угла а (рис. 2).

Окуляр 13 содержит глазную и собирательную линзы, которые увеличивают изображение, полученное при помощи объектива. На окулярах указано их увеличение (х5, х7, х10, х15). Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличе­ний окуляра и объектива: например, окуляр х10 и объектив х90 увеличивают объект в 900 раз. Важно получить не только увели­ченное, но и четкое изображение исследуемого объекта. Чет­кость изображения зависит от разрешающей способности микро­скопа, которую понимают как минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

Разрешающая способность микроскопа зависит от числовой апертуры пользуемого света. Например, апертура объектива х40 состав­ляет 0,65, конденсора — 1,0, использован зеленый свет с длиной волны 0,55 мкм, отсюда разре­шающую способность вычисляют по формуле

а = λ/(А₁+А₂),

где а — минимальное расстояние между двумя точками; Я —длина волны; А_х — числовая апертура объектива; Л₂ — числовая апертура конденсора.

Рис. 2. Схема хода лучей при разном значении угла а:

А — объект; О — объектив; и — половина отверстного угла

Следовательно, в приведенном примере а = 0,55/(0,65 + 1,0) = = 0,33 мкм, т. е. при этих условиях предел разрешения равен 0,33 мкм.

Повысить разрешающую способность микроскопа можно за счет применения более коротких лучей света или, что более дос­тупно, за счет приближения показателя преломления среды, гра­ничащей с линзой, к аналогичному показателю стекла. С этой целью прослойку воздуха между линзой объектива и предметным стеклом замещают специальной жидкостью с показателем пре­ломления, близким к показателю преломления стекла. Особенно это необходимо при использовании объективов большого увели­чения (х 90 и больше) с фронтальными линзами малой площади. Показатель преломления стекла и воздуха составляет соответ­ственно 1,52 и 1,0, поэтому в качестве иммерсионных жидко­стей, создающих оптически однородную среду между предмет­ным стеклом и линзой объектива, применяют чаще всего кедро­вое масло (л= 1,5), глицерин («= 1,4), воду («= 1,3). Ход лучей света при использовании обычного (сухого) и иммерсионного объективов показан на рисунке 3. Объективы для масляной им­мерсии обозначают МИ, водной — ВИ.

Если апертура конденсора меньше апертуры рабочего объек­тива, то из-за слабого потока света возможности линзы объекти­ва задействованы не полностью. Если апертура объектива мень­ше, чем апертура конденсора, что характерно для объективов ма­лого увеличения, то уменьшают диаметр отверстия ирисовой ди­афрагмы конденсора.

Микроскопы необходимо хранить под чехлами или колпаками для защиты от пыли. Для наружной очистки оптики применяют смоченные спиртом мягкие ткани, не оставляющие после себя волокон. Использование ксилола и бензина для этих целей мо­жет привести к расклеиванию линз.

При микроскопировании существенное значение имеет осве­щение исследуемого объекта. Освещение чаще устанавливают по методу Келлера.

Осветитель (желательно использовать стандартные освети­тели ОИ-7 и ОИ-19, содержащие микролампу с небольшой плотно скрученной спиралью, которую можно передвигать вдоль оси осветителя) располагают на расстоянии 30...40 см от микроскопа.

На предметный столик ставят препарат, в рабочее положе­ние переводят объектив х8.

3. Конденсор поднимают до упора, полностью открывают
ирисовую диафрагму.

Зеркало устанавливают плоской поверхностью и почти пол­ностью закрывают диафрагму осветителя.

Глядя в окуляр, при помощи зеркала получают в центре поля зрения изображение краев диафрагмы осветителя — светлое пятно с нерезко очерченными краями.

Используя объектив х 8, фокусируют объект в области свет­лого пятна.

Опуская конденсор, в плоскости препарата фокусируют изображение краев диафрагмы осветителя и движением зеркала переводят светлое пятно в центр поля зрения.

Диафрагму осветителя открывают до тех пор, пока светлое пятно не закроет все поле зрения.

10. В дальнейшем положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не меняют.

В работе с учебными микроскопами освещение нередко уста­навливают упрощенным способом. Приступая к работе с микро­скопом, проверяют состояние конденсора: он должен быть под­нят до уровня предметного столика, диафрагма открыта. При­подняв тубус микроскопа, устанавливают объектив с наимень­шим увеличением (х8, х10); глядя в окуляр, при помощи зеркала добиваются полного освещения поля зрения. Затем на исследуе­мый препарат наносят каплю кедрового масла (или его замените­ля), помещают препарат на предметный столик, поворотом ре­вольвера устанавливают иммерсионный объектив. (Чтобы избе­жать соприкосновения объектива со столиком, тубус следует дер­жать приподнятым.) Под контролем глаза (смотреть сбоку) фронтальную линзу объектива легким поворотом макрометри­ческого винта погружают в каплю иммерсионного масла и, на­блюдая в окуляр, осторожно поднимают тубус до видимости пре­парата. Затем легкими поворотами микрометрического винта (вперед-назад) регулируют четкость изображения.

В конце работы тубус приподнимают макровинтом, револьвер переводят в нейтральное положение, масло с линзы осторожно снимают мягкой хлопчатобумажной тканью. Микроскоп убирают в деревянный футляр или накрывают стеклянным колпаком (лучше из цветного стекла) для защиты от света.

Микроскопированием определяют морфологические особен­ности микроорганизмов, их тинкториальные свойства, подвиж­ность, наличие специальных структурных элементов (спора, кап­сула).

Чтобы исследовать под микроскопом живые нефиксирован­ные неокрашенные микроорганизмы, используют особые опти­ческие системы: фазово-контрастное устройство и темнопольный конденсор.

Фазово-контрастное устройство. Включает в себя: а) фазовую пластинку — расположенный в задней фокальной плоскости объектива прозрачный диск, на поверхность которого напылено кольцо из металлов (фазовое кольцо); б) кольцевую диафрагму — помещенную под конденсором светонепроницаемую пластину с прозрачным кольцевидным участком.

Световая волна при прохождении через живую клетку отстает по фазе приблизительно на '/₄ длины волны и дополнительно сдвигается еще на 'Д после прохождения через фазовую пластин­ку. Ход лучей в фазово-контрастном устройстве показан на ри­сунках 4, 5. Сдвинутые по фазе после прохождения через фазо­вую пластинку лучи либо совпадают и складываются с прямыми лучами, идущими мимо объекта, либо оказываются в противофазе. В первом случае исследуемый объект виден как светлый на темном фоне, а во втором — как темный на светлом фоне. В микробиологии широко применяют фазово-контрастное устрой­ство КФ-4 (рис. 6) (объект виден темным на светлом фоне). Да­лее приведена последовательность перехода к работе с фазово-контрастным устройством.

Обычный конденсор заменяют на фазово-контрастный, а объектив х40 — на аналогичный фазовый объектив.

Диск револьвера конденсора поворачивают до появления в окошечке цифры 0; диафрагму конденсора полностью открыва­ют.

Используя объектив х8, устанавливают освещение по Кел­леру.

Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и с помо­щью тубуса добиваются четкого изображения фазовой пластинки в виде темного кольца.

5. Устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую
объективу х40. В этом случае наряду с темным кольцом фазовой пластинки можно видеть светлое кольцо диафрагмы.

При помощи центрировочных винтов совмещают фазовое кольцо и кольцо диафрагмы.

Вспомогательный окуляр заменяют обычным и микроскопируют препарат. При работе с другими объективами устанавли­вают соответствующие диафрагмы.

Темнопольный конденсор. При темнопольной микроскопии ис­пользуют специальный конденсор с затемненной центральной частью, поэтому в плоскость объекта идут только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсо­ра. Лучи направлены под таким углом, что не попадают в линзу объектива, и поэтому поле зрения выглядит темным (рис. 7). Та часть лучей, которая попадает на объект, отражается в линзу объектива, что позволяет видеть светлое изображение объекта на темном фоне.

Вынимают окуляр, светлопольный конденсор и вывинчива­ют один из объективов (х 8).

Прикрывают диафрагму осветителя и фокусируют нить на­кала лампы на листе белой бумаги, помещенном на зеркале (см. п. 5 Установки освещения по Келлеру).

Раскрывают диафрагму осветителя, закрывают матовым стеклом конец тубуса и с помощью зеркала добиваются равно­мерного освещения поля зрения.

Ставят на место окуляр, объектив х8, темнопольный кон­денсор, положение зеркала при этом не меняют.

На линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды, на столик помещают препарат «раздавленная капля» таким образом, чтобы вода на линзе конденсора контактировала с ниж­ней поверхностью предметного стекла.

Глядя в окуляр, при помощи центрировочных винтов пере­водят в центр поля зрения светлое кольцо с темным пятном в центре. Далее регулируют видимость объекта в поле зрения.

Люминесцентный микроскоп {lumen — свет, escennt — слабое действие). Ветеринарно-бактериологические лаборатории снаб­жены люминесцентными микроскопами серии МЛ (рис. 8) и но­вой серии «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследовательского типа).

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люминогены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на бо­лее высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбуж­денное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на ста­бильны низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо-, рентгенолюминесценцию.

В лабораторной практике в основном используют фотолюми­несценцию—свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратко­временную—флуоресценцию, быстро затухающую после пре­кращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресценцию, продолжающуюся и после окончания возбуж­дения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отлича­ется от света возбуждения большей длиной волны, поэтому при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами получают длинноволновые све­чения объектов, хорошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первич­ная люминесценция присуща практически всем веществам, од­нако интенсивность свечения большинства из них невелика. В микробиологии чаще применяют вторичную люминесценцию: обрабатывают биологический объект (препарат) специальными красителями — флуорохромами (акридин оранжевый, аурамин, флуоресцеин, уранин, родамин и др.), которые обладают интен­сивной первичной люминесценцией. Флуорохромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при освещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами/В люминесцентных микроскопах источником возбуждения люминесценции служит ртутно-кварцевая лампа ДРШ-250. Что­бы провести успешную люминесцентную микроскопию: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помо­щью специальных светофильтров выделяют коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изу­чаемого объекта и отсекают лучи той же длины, что и лучи люми­несценции (в противном случае все поле зрения будет интенсив­но светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят светофильтры типов УФС-3, ФС-1, СС-4 и др., которые называют «возбуждающими» светофильтрами; 2) из све­тового потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропус­кают длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновре­менно защищают глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуж­дающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюда­теля помещают окулярные (запирающие) светофильтры типов ЖС-3, ЖС-18, Т-1Н и Т-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцент­ного микроскопа фильтров целевого назначения (возбуждающие, запирающие) называют принципом скрещенных фильтров. Эф­фект скрещенных светофильтров обеспечивает цветную флуо­ресценцию объектов на темном фоне поля зрения (зелено-жел­тую).

Существенное отличие серии «Люмам» от МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разными пара­метрами возбуждающего спектра и спектра люминесценции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильтрами и фильтрами возбуждающего света.

При люминесцентной микроскопии в качестве иммерсионной жидкости используют специальное нефлуоресцирующее масло (обычное иммерсионное масло для этих целей непригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заключается в том, что она дает цветное изображение, высокую степень кон­трастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах. В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флуорохромированных объектов и метод флуорес­цирующих антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекцион­ных болезней.

Электронный микроскоп. Длина волн видимой области спектра лежит в пределах 0,4...0,7 мкм, следовательно, максимальное раз­решение (половина длины волны), которое можно получить при помощи светового микроскопа, — около 0,2 мкм (200 нм). Волно­вые свойства также присущи электронам. При напряжениях 50 ООО... 100 ООО В длина волны электрона составит 0,0055... 0,0039 нм. По чисто техническим причинам получить теоретичес­ки максимальное разрешение, равное 0,002 нм, невозможно, и на практике оно не превышает 1...2 нм.

объекта. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной магнитной линзой, которая дает уве­личенное изображение; третья магнитная линза (проекционная), в свою очередь, также увеличи­вает изображение, которое и попадает на экран. Если люми­несцентный экран убрать, то луч попадает на фотопластинку.

Электронный микроскоп, создающий изображение при прохождении электронов через тонкопленочный образец, на­зывают трансмиссионным или просвечивающим.

В сканирую­щем электронном микроскопе первичный электронный луч, по­падая на поверхность фиксированного, высушенного и покрыто­го тонким слоем металла объекта, вызывает различные вторич­ные излучения, интенсивность которых зависит от характерис­тик рельефа, электропроводности и химического состава. Полез­ное увеличение сканирующей электронной микроскопии обычно не превышает 50 000 раз. С ее помощью получают трехмерное изображение объекта (рис. 11).

Основные формы бактерий. Форма бактерий различных таксо­номических групп разнообразна (рис. 12), и ее обязательно учи­тывают при идентификации микроорганизма.

Кокки. Это бактерии шаровидной формы. В зависимости от взаимного расположения клеток различают микрококки— отдельно лежащие кокки, диплококки — парно располо­женные кокки, стрептококки — цепочки кокков, ста­филококки— скопление кокков в виде виноградной грозди, тетракокки — структуры из четырех кокков, сарцины — многослойные структуры из 8... 16 кокков.

Палочковидные бактерии. Клетки цилиндрической формы, мо­гут располагаться одиночно, парами — диплобактерии, Цепочками — стрептобактериИ. Палочковидные бакте рии, образующие в неблагоприятных условиях специфическую форму существования — спору, диаметр которой не превышает диаметр клетки (аэробные палочковидные бактерии), называют бациллами. Если диаметр споры в клетке существенно пре­вышает ее поперечный диаметр, то такие спорообразующие бак­терии называют клостридиями (анаэробные палочки).

Извитые (спиралевидные) бактерии. К ним относят вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы — клетки в форме слегка изогнутых палочек; спириллы — бактерии, образующие до 6 завитков; спирохеты — бактерии со множеством (свыше 6) мелких завитков и в отличие от спирилл без жгутиков.

Ветвящиеся бактерии. Выраженная способность к ветвлению отмечена у прокариот из группы актиномицет; тенденцию к вет­влению на отдельных стадиях развития проявляют и другие бак­терии, например микобактерии.

Бактерии без постоянной формы. Микоплазмы лишены кле­точной стенки, поэтому их форма легко изменяется.

У большинства бактериальных клеток нет дифференциации на передний и задний концы, нижнюю и верхнюю стороны, т. е. функционально они равноценны, хотя есть исключения.

Полиморфизм. Это свойство некоторых видов бактерий в про­цессе роста на питательных средах образовывать формы, отлича­ющиеся от типичной.

Определение размеров микроорганизмов. Размеры бактерий ва­рьируют в широких пределах — от 0,2 мкм (микоплазмы) до 125 мкм {Ochromotium oxaliferum). Размеры большинства патоген­ных бактерий составляют от нескольких десятых микрометра до нескольких микрометров.

При характеристике размеров бактерий обычно указывают длину и ширину клетки в микрометрах (10~³мм). В качестве инструментов измерения используют окуляр- и объект-микро­метры..

Окуляр-микрометр. Это стеклянная пластинка, на которой ли­ния в 5 мм разделена на 10 или 20 делений (размещают в окуляре).

Объект-микрометр. Представляет собой предметное стекло с линией длиной 0,5 или 1,0 мм, разделенной на сотые доли (рис. 13, 14).

Объект-микрометр помещают на предметный столик и, глядя в окуляр с окуляр-микрометром, совмещают начальную черту в объект- и окуляр-микрометрах. Затем определяют цену деления окуляр-микрометра при данных окуляре и объективе. Например: шкала объект-микрометра составляет 1 мм и одно ее деление равно 10^-2 мм, т.е. 10мкм.

При совмещении шкалы объект-микрометра три его деления (т. е. 30 мкм) соответствуют 14 делениям окуляр-микрометра, от­сюда одно деление окуляр-микрометра составляет 30: 14 = 2,14 мкм. После того как определена цена одного деления оку­ляр-микрометра, вместо объект-микрометра помещают препарат с исследуемым объектом. Например, палочковидный микроб по длине занимает 3, а по ширине — 0,5 деления окуляр-микромет­ра. Если одно деление окуляр-микрометра составляет 2 мкм, то длина бактериальной клетки будет 3-2 = 6 мкм, а ширина — 0,5 • 2 = 1 мкм.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Ознакомиться с бактериологической лабораторией, ее ос­новным оборудованием, правилами техники безопасности.

Изучить устройство светового микроскопа, установку осве­щения по Келлеру, принципы фазово-контрастной, темнопольной, люминесцентной и электронной микроскопии.

3. Освоить приемы работы с иммерсионным объективом мик­роскопа.

Провести микроскопию препаратов с бактериями различ­ной формы.

Определить размеры бактериальных клеток.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные правила работы в бактериальной лаборатории?

2. Как проходят лучи в иммерсионной системе, фазово-контрастном устройстве микроскопа, темнопольном конденсоре, люминесцентном микроскопе?

3. Каковы основные формы бактерий?

4. Как определяют размеры микроорганизмов?

Тема 2

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с основными бактерио­логическими красителями, техникой их приготовления и мето­дом простой окраски бактериальных препаратов.

Оборудование и материалы. Набор сухих бактериологических красок и их растворов, культуры бактерий на МПА и в МПБ (Е. coli, S. aureus), световые микроскопы, обезжиренные пред­метные стекла, фуксин Пфейффера, красящие бумажки по Си­неву, раствор метиленового синего, фильтровальная бумага для высушивания мазков, физиологический раствор.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Обычно форму, взаимное расположение, некоторые особенно­сти химического состава и строения бактериальных клеток опре­деляют путем микроскопии окрашенных препаратов. Оптическая плотность неокрашенных бактерий близка к оптической плотнос­ти стекла, поэтому бактерии плохо различимы при микроскопиро-вании. Окрашенные клетки, наоборот, четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя.

Отношение к различным красителям и методам окраски на­зывают тинкториальными свойствами микроорганизмов.

Бактериологические красители. Для окрашивания бактериаль­ных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимо­действующие с красителем, преимущественно отрицательно за­ряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Основные красители. Красные (нейтральный красный, пиро-нин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиоле­товый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зеленые (малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, янус зеленый); коричневые (везувин, хризоидин); черные (индулин).

Кислые красители. Розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); желтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); черные (нигрозин).

Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения го­товят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдержи­вают в термостате для лучшего растворения веществ, затем филь­труют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нераство­рившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседа­ют на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроско­пом.

Далее приведены рецепты спиртовых растворов красок, наи­более часто применяемых в микробиологии.

Карболовый фуксин Циля: раствор А: основной фуксин —0,3 г, 96%-й этанол —10 мл; раствор Б: фенол — 5 г, вода дистиллированная — 95 мл. Растворы А и Б смешивают.

Фуксин Пфейффера — это фуксин Циля, разведен­ный водой в соотношении 1: 10 (из-за нестойкости используют только в течение рабочего дня).

Карболовый кристаллический фиолето­вый: раствор А: кристаллический фиолетовый — 0,4 г, 96%-й этанол — 10 мл; раствор Б: фенол — 1 г, вода дистиллирован­ная — 100 мл. Растворы А и Б смешивают.

Щелочной метиленовый синий Леффлер а: раствор А: метиленовый синий — 0,3 г, 96%-й этанол — 30 мл; раствор Б: 0,01%-й раствор гидроксида калия — 100 мл. Ра­створы А и Б смешивают.

Водные растворы. Так как эти растворы красителей нестойкие, их готовят непосредственно перед использованием (ex tempore).

Раствор сафранина: сафранин — 2 г, вода дистилли­рованная горячая (/= 90 °С) — 100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор малахитового (бриллиантового) зеленого: малахитовый зеленый — 1 г, вода дистиллирован­ная горячая —100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор Люголя — стойкий раствор используют для окраски по методу Грама: йод кристаллический — 1 г, йодид ка­лия—2 г, вода дистиллированная — 10 мл. Смесь выдерживают 24 ч при 37 °С, после чего добавляют дистиллированную воду до 300 мл и одну-две капли глицерина.

Приготовление бактериальных препаратов для световой микроско­пии. Приготовление окрашенных бактериальных препаратов вклю­чает в себя приготовление мазка, его высушивание, фиксацию и окрашивание. Материалом для исследования служат культуры бак­терий на плотных или жидких питательных средах или нативный материал: органы, ткани, воспалительный экссудат и т. д. Препара­ты готовят на чистых, обезжиренных предметных стеклах.

На предметное стекло наносят исследуемый материал. Если материал жидкий и находится в бактериологической пробирке (бульонная культура), то пробирку берут в левую руку, в пра­вую — бактериологическую петлю (как пишущее перо), прожига­ют ее в пламени горелки, мизинцем правой руки захватывают пробку и над пламенем горелки извлекают ее из пробирки, края пробирки обжигают. Петлей, не смачивая петледержатель, берут материал и распределяют на предметном стекле по площади раз­мером 2 см². Края пробирки вновь обжигают, закрывают ее проб­кой, обжигают бактериологическую петлю.

Аналогичным образом готовят мазок из агаровой культуры, осторожно захватывая петлей бактериальную массу с поверхнос­ти питательной среды. На предметное стекло в этом случае пред­варительно наносят каплю стерильного физиологического ра­створа, в котором петлей суспендируют бактериальную массу.

Из животных тканей готовят мазки-отпечатки: стерильно вы­резают кусочек органа, поверхностью среза несколько раз каса­ются поверхности предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе.

Мазок фиксируют для прикрепления бактериальных клеток к поверхности стекла и их инактивации. Применяют физичес­кий и химический способы фиксации. При физическом способе препарат обратной стороной стекла два-три раза ме д­ ленно проводят над пламенем горелки. Чрезмерное нагревание вызывает изменение формы клетки и ее тинкториальных свойств. При химическом способе на предметное стекло с маз­ком наносят одну из следующих жидкостей: 96%-й этанол — на 10 мин; ацетон — на 5 мин; смесь этанола и эфира (соотношение 1: 1) — на 10...15 мин.

Фиксированный препарат окрашивают одним из методов.

Раствор краски смывают дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.

Процедуру окрашивания препарата проводят на «мостике» (параллельные стеклянные трубки) над сливной чашкой.

Простые методы окраски бактерий. При этом способе окраши­вания используют один краситель: например, на мазок наносят фуксин Пфейффера на 2...3 мин или метиленовый синий Леффлера на 3...10 мин. В таком препарате можно определять форму клеток, их взаимное расположение.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур, окрасить одним из красителей простым методом.

Контрольные вопросы

1. Какие бактериологические красители наиболее часто применяют в лабораторной практике?

2. Как их готовят?

Тема 3

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ: ОКРАСКА ПО МЕТОДАМ ГРАМА И ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА

Цель занятия. Ознакомить студентов со сложными методами окраски, с помощью которых дифференцируют грациликутные, фирмикутные и кислотоустойчивые бактерии.

Оборудование и материалы. Смесь культур Е. соli иS. aureus, смесь Е. coli, S. aureus и микобактерий (вакцина БЦЖ), красители для окраски бактерий по методам Грама и Циля-Нильсена, све­товые микроскопы, бактериологические петли, 96%-й этанол, фильтровальная бумага, предметные обезжиренные стекла, 5%-й раствор серной кислоты, дистиллированная вода.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

При сложных методах окраски используют несколько различ­ных красителей, что позволяет выявить особенности строения и химического состава клетки.

Окраска бактерий по методу Грама. Это один из наиболее рас­пространенных сложных методов окраски, основан на различиях в строении и химическом составе клеточной стенки. В зависимо­сти от результатов окрашивания все бактерии подразделяют на грамположительные и грамотрицательные.

При окрашивании генциановый фиолетовый в присутствии йода образует комплекс с компонентами клеточной стенки. У грамположительных прокариот клеточная стенка при обработке этанолом удерживает образовавшийся комплекс и бактерии ок­рашены в фиолетовый цвет; у грамотрицательных этанол вымы­вает этот комплекс и после дополнительного окрашивания пре­парата фуксином клетки приобретают красный цвет.

Этапы окраски. На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генциан кристалл- или метилвиолета (бумажки по Синеву), на­носят на нее несколько капель дистиллированной воды для ув­лажнения, выдерживают 1...2мин, бумажку удаляют. Препарат, не промывая, обрабатывают раствором Люголя 1...2мин; раствор сливают. Затем наносят 96%-й этанол на 30...45 с, после чего препарат тщательно промывают водой и окрашивают фуксином Пфейффера 1...2мин. Вновь промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Микроскопическая картина: бактерии, окрашенные в темно-фиолетовый цвет, относят к грамположительным, или фирмикутам, в красный цвет — к грамотрицательным, или грациликутам.

Основная сложность окраски по методу Грама — опасность переобесцвечивания препарата этанолом.

Чтобы избежать пере­обесцвечивания, разработан ряд модификаций, например моди­фикация Хукера.

Модификация Хукера. Готовят следующие красители: раствор А- кристаллвиолет — 2 г, 96%-й этанол — 20 мл; раствор Б: окса-лат аммония — 0,8 г; дистиллированная вода — 80 мл. Растворы А и Б смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Раствор В: 2,5%-й раствор сафранина (в 96%-м этаноле) — 10 мл, дистиллированная вода — 100 мл.

Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь ра­створов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают. Наносят 96%-й этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бу­магой и окрашивают раствором В 10 с, промывают водой, подсу­шивают и микроскопируют.

Окраска бактерий по методу Циля-Нильсена. Кислотоустой­чивые бактерии — грамположительные, однако повышенное со­держание в клеточной стенке липидов и миколовой кислоты придает клетке гидрофобные свойства, затрудняющие проник­новение в нее красителя и усиливающие ее устойчивость к воз­действию растворов кислот. Исходя из этих особенностей был разработан метод, с помощью которого выявляют кислотоус­тойчивые виды.

Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумажку (1 см²) карболовым фуксином Циля с подогреванием до появления паров; оставляют на «мостике» до остывания, повто­ряют нагрев. Общая экспозиция З...7мин. Бумажку удаляют, краску сливают, на препарат, не промывая водой, наносят 3...5%-й раствор серной кислоты на 5...7 с. Затем препарат про­мывают водой и окрашивают раствором метиленовой сини Леф-флера 4...5 мин, после чего промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислота не обесцветила кислото­устойчивые бактерии, и они окрашены в красный цвет; некисло­тоустойчивые бактерии восприняли дополнительный синий кра­ситель.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Из культур Е. coli и S. aureus приготовить мазки, окрасить по методу Грама, промикроскопировать и зарисовать.

Приготовить из смеси микобактерий (БЦЖ), Е. coli, S. aureus мазки, окрасить по методу Циля-Нильсена, промикро­скопировать и зарисовать.

Контрольные вопросы

1. Чем обусловлены тинкториальные особенности грамположительных и грамотрицательных бактерий?

2. На каких особенностях кислотоустойчивых бактерий основан метод окраски по Цилю-Нильсену.

Тема 4

ОКРАСКА БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР, КАПСУЛ, ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ВКЛЮЧЕНИЙ. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ЖГУТИКОВ. МЕТОД ПРЯМОГО ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Ознакомить студентов с методами обнаружения у бактерий спор, капсул, жгутиков, цитоплазматических включе­ний методом прямого флуорохромирования бактерий.

Оборудование и материалы. 24-часовая культура P. multocida на сывороточном МПА, культура В. cereus на МПА на стадии спо­рообразования; сенной настой, красители, предметные и по­кровные стекла, световые микроскопы.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Выявление бактериальных спор. Спора - особая форма суще­ствования грамположительных бактерий, формируется эндоген­но, характеризуется специфическими структурами (многослой­ные белковые покровы, наружная и внутренняя мембраны, кортекс) и повышенной устойчивостью к неблагоприятным факто­рам внешней среды.

Споры с большим трудом воспринимают красители, но проч­но удерживают их после окраски (рис. 15)

Рис. 15. Бациллы с различным располо­жением спор:

1 — вегетативная клетка; 2— субтерминаль­ное; 3 — центральное; 4— терминальное

На этой особенности спор основаны все методы их выявления. Для окрашивания спор применяют красители с протравителями (карболовый фуксин и др.) и подогревание, чтобы увеличить проницае­мость оболочки. Для разрыхления оболочки иногда перед окрас­кой препараты обрабатывают хромовой или другими неоргани­ческими кислотами.

Метод Мёллера. Фиксированный мазок обрабатывают 5%-м раствором хромовой кислоты при легком подогревании 10 мин, промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой. Затем на фильтровальную бумагу (1 см²), помещенную на мазок, нано­сят карболовый фуксин и подогревают до появления паров, дают остыть, повторяют нагревание два-три раза. Общая экспозиция окрашивания карболовым фуксином 7 мин (мазок должен быть влажным). Бумажку с краской сбрасывают бактериальной пет­лей; не промывая водой, мазок обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты 5...7 с, после чего тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим 3 мин. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: споры окрашены в розово-крас­ный цвет, вегетативные клетки — в синий.

Метод Вальдмана..На фиксированный мазок наносят щелоч­ную синьку Леффлера и нагревают до кипения, дают остыть и промывают водой. Докрашивают 1%-м водным раствором нейт-ральрота 30 с, промывают водой, подсушивают.

Микроскопическая картина: споры синие, вегетативные клет­ки красные.

Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиле­новым синим с подогреванием до закипания, затем промывают водой и докрашивают 1%-м водным раствором нейтральрота 10 с. Препарат промывают водой, подсушивают.

Микроскопическая картина: споры синие, вегетативные клет­ки красные.

Метод Ауески. Нефиксированный мазок обрабатывают 0,5%-м раствором соляной кислоты 2...3 мин при подогревании, затем промывают водой и фиксируют над пламенем. Окрашивают кар­боловым фуксином Циля при подогревании 7...8 мин. Краску сливают и препарат обрабатывают 5%-м раствором серной кис­лоты 5...7 мин, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 4...5 мин, после чего вновь промывают водой и подсуши­вают.

Микроскопическая картина: споры красные, вегетативные клетки синие.

Метод Шеффера-Фултона. Фиксированный мазок покрыва­ют фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-й водный раствор малахитовой зелени и выдерживают 5 мин над кипящей водой, после чего промывают водой и окрашивают 2%-м водным ра­створом сафранина 30 с. Препарат промывают водой, подсуши­вают.

Микроскопическая картина: споры зеленые, вегетативные клетки красно-коричневые.

Выявление капсул бактерий. Капсула — это слизистое образо­вание, обволакивающее клетку и сохраняющее связь с клеточной стенкой. У большинства прокариот капсула построена из полиса­харидов гомо- или гетерополимерной природы. У некоторых ви­дов бактерий капсула содержит полипептид — полимер D-тяута-миновой кислоты. Вещество капсулы обычно воспринимает кра­сители слабее, чем другие клеточные компоненты, поэтому при специальных методах окраски можно дифференцировать капсулу от остальных структур. Многие виды патогенных бактерий обра­зуют капсулу, которая выполняет защитную функцию в основ­ном за счет снижения эффективности фагоцитоза (рис. 16).

Метод Михина. Препарат окрашивают щелочной синькой Леффлера с подогреванием до появления паров и затем выдер­живают еще 5...6 мин (мазок должен быть влажным). Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Обычно используют старые растворы красителя, так как у них больше выражена способность к метахроматической окраске.

Микроскопическая картина: капсула розовая, клетки синие.

Метод Ольта. Фиксированный мазок окрашивают при подо­гревании 2%-м водным раствором сафранина, приготовленным ex tempore. Экспозиция окрашивания 1...2мин. Затем промывают водой, подсушивают. На мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом.

Микроскопическая картина: капсула бледно-желтая, клетка красно-коричневая.

Микроскопическая картина: капсулы сине-фиолетовые, клет­ки темно-синие.

Метод Романовского—Гимзы. Препарат, фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова, кладут мазком вниз в чашку Петри с подставками (деревянные или стеклянные палочки). Под препарат наливают краску Романовского-Гимзы (15...20 ка­пель краски на 10 мл дистиллированной воды). Выдерживают 15...20 мин. Препарат промывают водой, подсушивают.

Микроскопическая картина: капсула розовая, клетка темно-синяя.

Метод Ребигера. Нефиксированный мазок окрашивают 15...20 с раствором генцианвиолета в формалине (генцианвиолет— 15...20 г, 40%-й раствор формалина — 100 мл, раствор от­стаивают, фильтруют). Препарат промывают водой, подсуши­вают.

Микроскопическая картина: капсула красно-фиолетовая, клетка темно-фиолетовая.

В мазках-отпечатках из тканей больного животного капсулированные клетки легко обнаружить благодаря контрастирующе­му фону, который образован плазмой и тканевыми элементами. Для имитации подобного фона при выявлении капсул у клеток бактериальных культур разработаны специальные методы ок­раски.

Метод Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови животного любого вида, петлей вносят в нее и суспендируют изучаемую культуру. Суспензию распределя­ют равномерным тонким слоем по поверхности стекла. Препарат фиксируют на пламени и окрашивают 0,1%-м водным раствором кристаллвиолета 1 мин. Мазок промывают 20%-м водным ра­створом сульфата меди, подсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: капсула бледно-голубая, клетка темно-фиолетовая, фон фиолетовый.

Метод Гинса. На край предметного стекла помещают каплю черной туши, предварительно разведенной дистиллированной водой в соотношении 1: 3 и центрифугированной при 3000 мин^-1 15 мин. В капле туши петлей суспендируют бактериальную массу. Вторым предметным стеклом суспензию равномерно распреде­ляют по поверхности стекла, т. е. мазок готовят так же, как мазки из капли крови. Мазок высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным дистил­лированной водой в соотношении 1:3. Экспозиция окрашива­ния 4...5 мин. Препарат промывают водой и подсушивают.

Микроскопическая картина: капсула видна как светлый или розовый ободок вокруг темно-красных клеток бактерий, общий фон за счет туши черный.

Выявление цитоплазматических включений. При идентификации прокариот имеет значение обнаружение в их цитоплазме скоплений определенных химических веществ (включений): по­лифосфатов — волютина (метахроматина), полисахаридов — глюканов, состоящих из Д-глюкозы и некоторых других соединений.

Обнаружение волютина (по методу Нейссера). Готовят четыре раствора. Раствор А: метиленовый синий —0,1 г, 96%-й эта­нол — 2 мл, ледяная уксусная кислота — 5 мл, вода дистиллиро­ванная — 300 мл. Раствор Б: кристаллвиолет — 1 г, 96%-й эта­нол — 100 мл, вода дистиллированная — 300 мл. Раствор В: ра­створ Люголя. Раствор Г: хризоидин — 1 г, вода дистиллирован­ная — 300 мл.

На фиксированный препарат наливают смесь растворов А и Б в соотношении 2: 1 на 1 мин, краску сливают. Мазок, не промы­вая, обрабатывают раствором В 1 мин и промывают водой. Затем на препарат наносят раствор Г на 2...3 мин, промывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: клетки светло-желтые, зерна во­лютина темно-синие.

Обнаружение поли-β-оксимасляной кислоты. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 0,3%-м раствором Судана черного «В» в этиленгликоле 5... 15 мин. Краску сливают и препарат, не промывая, подсушивают на воздухе, затем ополаскивают в кси­лоле, высушивают и погружают в 0,5%-й водный раствор сафра­нина на 5...10 с, промывают водой, подсушивают.

Микроскопическая картина: включения видны на розовом фоне в виде черно-синих зерен.

Обнаружение полисахаридов. На фиксированный препарат на- • носят 1%-й спиртовой раствор алцианового синего на 1 мин (краситель перед использованием разводят водой в соотношении 1:8). Препарат промывают водой, подсушивают, затем обраба­тывают карболовым фуксином Циля и сразу же промывают во­дой, подсушивают.

Микроскопическая картина: цитоплазма красного цвета, по-лисахаридные включения — голубого.

Методы обнаружения жгутиков у бактерий. Жгутики — структу­ры нитевидной формы, белковой природы, определяют способ­ность клетки к движению в жидкой среде (рис. 17). Количество и характер расположения жгутиков у бактерий различны. У монотрихов один-два жгутика расположены на одном из полюсов клетки (Pseudomonas); у лофотрихов пучок жгутиков расположен полярно или субполярно (Spirillum); у амфитрихов жгутики —на обоих полюсах клетки; у перитрихов — по всей поверхности клетки (Enterobacteriaceae).

Монотрихи двигаются прямолинейно и поступательно, при необходимости могут изменить направление движения на 180° (клетка переворачивается); движение лофотрихов прямолинейное вперед или назад; перитрихи передвигаются хаотично (рис. 18).

Жгутики легко повредить, поэтому препараты готовят с боль­шой осторожностью. Стекла используют чисто вымытые, без ца­рапин. Исследуемая культура должна быть не старше 12...18 ч. Бактериальную массу осторожно вносят в пробирку с нескольки­ми миллилитрами физиологического раствора. Суспензию вы­держивают 15...20 мин в термостате, затем петлей каплю жидко­сти из пробирки осторожно переносят на предметное стекло, вы­сушивают, фиксируют на пламени и окрашивают одним из спе­циальных методов.

Метод серебрения по Морозову. Готовят четыре раствора. Ра­створ А: вода дистиллированная — 100 мл, 40%-й раствор форма­лина — 2 мл, ледяная уксусная кислота — 1 мл. Раствор Б: та­нин — 5 г, жидкая карболовая кислота — 1 мл, вода дистиллиро­ванная — 100 мл. Раствор В: нитрат серебра —5 г, дистиллиро ванная вода — 100 мл. К 80 мл этого раствора по каплям добавля­ют аммиак до растворения осадка и образования легкой опалес-ценции. Для окраски раствор серебра разводят дистиллирован­ной водой в соотношении 1: 10.

На препарат наносят раствор А на 1 мин, затем раствор слива­ют и препарат промывают водой, обрабатывают раствором Б и подогревают 1 мин до отхождения паров, промывают водой, пос­ле чего наносят раствор В и подогревают 1...2мин до появления темно-коричневой окраски мазка, промывают водой, подсуши­вают.

Микроскопическая картина: тела бактерий угольно-черного цвета, жгутики в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или жел­товатом однородном фоне.

В повседневной бактериологической работе чаще используют косвенные методы обнаружения жгутиков — выявляют подвиж­ность клеток исследуемой бактериальной культуры.

Препарат «раздавленная капля». На чистое обезжиренное предметное стекло пастеровской пипеткой наносят одну-две капли 18...20-часовой бульонной культуры, накрывают чистым покровным стеклом. Количество жидкости должно быть доста­точным для заполнения всего пространства под покровным стек­лом. Микроскопируют с объективом х 40 или х 90. Неокрашен­ные бактерии лучше видны при легком затемнении поля зрения, поэтому конденсор целесообразно опустить на 5... 10 мм ниже плоскости предметного столика. Клетки видны в виде светлых или серых «теней», при объективе х 90 четко видны только клет­ки, передвигающиеся в горизонтальной плоскости; бактерии, двигающиеся вертикально, быстро уходят из зоны четкого изоб­ражения.

Препарат «висячая капля». Каплю исследуемой культуры бак­териологической петлей наносят на чистое покровное стекло. Берут специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре, края лунки смазывают вазелином, стекло переворачива­ют лункой вниз и прижимают к покровному таким образом, что­бы капля с бактериями была в центре лунки. Затем предметное стекло резко переворачивают, и капля зависает под покровным стеклом в лунке. При микроскопии бактериальные клетки легче обнаружить по краю капли, где слой жидкости тоньше.

Активное движение бактерий необходимо дифференцировать от броуновского — колебаний клетки под ударами молекул воды и пассивного движения всех клеток с током жидкости в одну сто­рону при наличии уклона.

Помимо перечисленных методов для выявления жгутиков не­редко прибегают к посеву исследуемой культуры уколом в полу­жидкий агар (см. тему 8). Подвижные бактерии растут по всей питательной среде в пробирке, неподвижные — только по уколу.

Метод прямого флуорохромирования бактерий. Для обнаруже­ния некоторых видов бактерий и их отдельных структур препара­ты обрабатывают флуорохромами с последующим изучением в люминесцентном микроскопе. Наиболее широко этот метод применяют для выявления возбудителя туберкулеза.

Готовят следующие растворы: раствор А (фиксатор Никифо­рова): 96%-й этанол, серный эфир —в соотношении 1:1; ра­створ Б: аурамин 00 —0,1 г, дистиллированная вода—100мл, 6%-й раствор фенола — 0,5 мл; раствор В: 96%-й этанол — 90 мл, соляная кислота — 4 мл, хлорид натрия — 4 г, объем доводят дис­тиллированной водой до 100 мл; раствор Г («тушитель»): кислый фуксин—1 г, дистиллированная вода —390мл, концентриро­ванная уксусная кислота — 10 мл.

Мазки из исследуемого материала готовят, как для обычной микроскопии, фиксируют раствором А; окрашивают раствором Б 15 мин, промывают водой, затем обрабатывают раствором В 5 мин, промывают водой, наносят раствор Г на 2 мин, после чего препарат промывают водой и подсушивают.

Микроскопическая картина: при объективе х40 туберкулез­ные бактерии видны в виде золотистых черточек; под объекти­вом х 90 (иммерсионным) на темном фоне обнаруживают светя­щиеся золотисто-зеленые палочки возбудителя.

Демонстративен способ выявления спор бактерий при окра­шивании бриллиант-сульфофлавином, трипафлавином.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Приготовить, окрасить и промикроскопировать препарат бактерий со спорами (В. cereus).

Окрасить одним из способов капсулы P. multocida и про­микроскопировать.

Приготовить препарат «раздавленная капля» из сенного настоя, обнаружить методом микроскопии подвижные клетки бактерий.

Контрольные вопросы

На каких тинкториальных особенностях спор и капсул основаны методы их окраски?

Какие прямые и косвенные методы применяют для обнаружения бактери­альных жгутиков?

Какое значение имеет выявление цитоплазматических включений для иден­тификации прокариот?

Тема 5

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ

Цель занятия. Ознакомить студентов с особенностями морфо­логии и методами исследования микроскопических грибов раз­личных таксономических групп.

Оборудование и материалы. Грибные культуры родов Мисог, Penicillium, Aspergillus, Fusarium на плотных средах в чашках Пет­ри, суспензия дрожжей в бактериологических пробирках, пред­метные и покровные стекла, микологические крючки или препа­ровальные иглы, световой микроскоп.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Грибы — это хемоорганотрофные микроорганизмы с эукариотической клеточной организацией, лишены фотосинтетических пигментов, широко распространены в природе. Грибы относят к царству Fungi (лат.) или Mycota (греч.), включающему в себя око­ло 120 000 видов. Для ветеринарии наибольшее значение имеют микроскопические грибы, вызывающие патологию у животных и людей, — представители родов Aspergillus, Penicillium, Мисог, Fusarium, Candida, Histoplasma, Coccidioides, Stachybotrys, Dendrodochium.

Морфология грибов. У большинства видов вегетативное тело (таллом) состоит из ветвящихся нитевидных клеток (гифов), об­разующих мицелий, или грибницу. Нитевидные грибы (гифомицеты) условно называют плесневыми. Существуют и одноклеточ­ные неветвящиеся грибы — дрожжи, дрожжеподобные (рис. 19).

Различают мицелий субстратный, контактирующий с пита­тельной средой, и воздушный, возвышающийся над нею. Попа­дая в субстрат, гифы растут концевыми участками и ветвятся радиально от центра инокуляции к периферии, формируя коло­нию. Для прикрепления к субстрату и потребления из него пита­тельных веществ мицелий у некоторых видов образует корешкообразные выросты — ризоиды. К видоизменениям ми­целия относят также склероции — округлые или продолговатые сплетения гифов, содержащие много питательных веществ, не­обходимых грибу при неблагоприятных условиях (рис. 20).

По строению мицелия грибы подразделяют на два класса.

Низшие грибы (фикомицеты). Этот класс характеризуется несептированным мицелием, который представлен одной сильно разветвленной гигантской клеткой без перегородок и с много­численными ядрами.

Высшие грибы (микомицеты). Характеризуются септированным мицелием: гифы мицелия разделены перегородками (септы,септумы) на отдельные одноядерные или многоядерные клетки. Цитоплазма одной клетки сообщается с цитоплазмой соседней через пору в центре перегородки. У некоторых высших грибов (дрожжи) мицелий отсутствует, а вегетативное тело представлено отдельными клетками с клеточной стенкой. Если в процессе де­ления или почкования дрожжевые клетки не расходятся, то обра­зуются скопления клеток, которые называют ложным мицелием (псевдомицелием) (см. рис. 19).

Размножение грибов. Различают вегетативный и репродуктив­ный способы размножения.

Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 2406 | Нарушение авторских прав