АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорганизмы или подавлять их рост
Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорганизмы или подавлять их рост. Абсолютное большинство известных антибиотиков получают из актиномицетов. Бактерии синтезируют такие антибиотики, как полимиксины, грамицидины, бацитрацин, гризин. Из грибов выделены пенициллины, цефалоспорины, фумагиллин, гризеофульвин, из животных тканей — эритрин, экмолин, из высших растений — аллицин и др. Часть антибиотиков получают химическим синтезом (левомицетин), а большинство — биосинтезом. Активность препаратов определяют бактериологическими или физико-химическими методами. Биологическую активность антибиотиков выражают в условных единицах действия — ЕД. За 1 ЕД принимают специфическую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата, но для бензил пенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в мкг активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата.
Успех лечения инфекционных заболеваний человека и животных зависит от выбора эффективного лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя болезни. Материал для лабораторного исследования следует брать до лечения антимикробными препаратами. Чувствительность микроорганизма к антибиотикам определяют с чистой культурой возбудителя.
Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. К ним относят метод диффузии в агар, метод серийных разведений (на жидкой и плотной питательных средах) и ускоренные методы.
Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков). Это наиболее простой в исполнении метод. В качестве питательной среды применяют МПА, агар на переваре Хоттингера с содержанием 120...140мг% аминного азота (рН 7,2...7,4) или агар фирмы «Дифко». Диски с антибиотиками (диаметр 5...6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск содержит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпают силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении меняет окраску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для использования непригодны. Флаконы с дисками хранят при температуре 4...20 "С.
Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4...5 мм). Перед посевом чашки со средой досушивают в термостате. Для посева используют суточную бульонную культуру или смывы суточной агаровой культуры. 1 мл микробной суспензии в физиологическом растворе (концентрация клеток 109/мл) наносят на агар и покачиванием чашки распределяют по поверхности питательной среды. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Засеянные чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30...40 мин, а затем на поверхность среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37 °С 18 ч в положении вверх дном.
Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким образом вокруг диска зону отсутствия роста (рис. 49). Ближе к диску концентрация антибиотика в агаре выше, по мере удаления от диска концентрация снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задержки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.
Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки роста микроорганизмов вокруг диска указывает на устойчивость исследуемой культуры к данному антибиотику. При зоне задержки роста до 14 мм говорят о малой чувствительности к антибиотику, от 15 до 25 мм — о достаточной чувствительности, свыше 25 мм — о высокой чувствительности.
а — к пенициллину; б— к стрептомицину; в — к неомицину; /—зона задержки роста (стерильная зона); 2 — сплошной рост бактерий на поверхности питательной среды; 3 — бумажный диск с антибиотиком
Чтобы получить более точные результаты исследования, необходимо соблюдать стандартные условия при постановке опыта. Для проверки точности и стандартности определения чувствительности к антибиотикам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорганизмов, которыми служат три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, №СТС 6571), E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662).
Метод серийных разведений. Для проведения опыта готовят основные растворы антибиотиков, используя стандарты антибиотиков. На этикетке ампулы со стандартом указана концентрация антибиотика в ЕД/мл или мкг/мл. Навески бензил пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина тригидрата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15M фосфатном буфере. Основные растворы тетрациклиновых антибиотиков готовят на 0,01 н. растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина используют дистиллированную воду. Концентрация основных растворов антибиотиков 1000 мкг/мл.
Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: при определении чувствительности к антибиотикам для основной массы микроорганизмов используют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для стрептококков в среду добавляют 1 % глюкозы, для патогенных грибов используют среду Сабуро.
Агаровые или бульонные культуры микроорганизмов предварительно разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5 • 106/мл.
Схема опыта приведена в таблице 2.
Учет результатов: наименьшее количество антибиотика, дающее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), соответствует минимальной подавляющей концентрации препарата (МПК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют высевом на плотные питательные среды из последних прозрачных пробирок, которые предварительно встряхивают. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24...72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принимают за МБцК.
Метод серийных разведений на плотной питательной среде: для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или агар на переваре Хоттингера с содержанием аминного азота 120...140мг/мл, рН 7,2...7,4. Приготовленный основной раствор антибиотиков разводят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлажденному до 55 ºС агару, разлитому в широкие пробирки по 18 мл, добавляют по 2 мл соответствующего разведения определенного антибиотика, тщательно перемешивают и переливают в стерильную чашку Петри. После застывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Контрольные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засевают исследуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 106...107/мл. Чашки помещают в термостат при 37 ºС на 20...24 ч.
Наименьшую концентрацию антибиотика, при которой наблюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост единичных колоний, принимают за МПК препарата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, считают, что исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК препарата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем концентрациям антибиотика.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Определить чувствительность культуры стафилококка к антибиотикам методом бумажных дисков.
Контрольные вопросы
1.Что такое антибиотики?
2.Как используют антибиотики в ветеринарии?
3.Какими методами определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам?
4.Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?
Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1084 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 |
|