ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САПА, МЕЛИОИДОЗА И ПСЕВДОМОНОЗА НОРОК. БИОПРЕПАРАТЫ
Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудителей и лабораторной диагностикой сапа, мелиоидоза, псевдомоноза норок и биопрепаратами.
Оборудование и материалы. Культуры P. aeruginosa на МПА в чашках Петри, в МПБ, набор тестов, характеризующих ферментативные свойства P. aeruginosa, покровные стекла для препарата «раздавленная капля», биопрепараты для специфической профилактики и диагностики сапа и псевдомоноза норок.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Сап. Это инфекционная, хронически протекающая болезнь однокопытных животных (лошади, ослы, мулы, лошаки); восприимчивы представители семейства кошачьих и человек. Характеризуется возникновением в легких, на слизистой оболочке носа и различных участках кожи специфических узелков, склонных к распаду с образованием гноящихся язв.
Возбудитель сапа — бактерия Pseudomonas mallei, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.
Лабораторная диагностика сапа основана на результатах серологических исследований (РСК); бактериологическое исследование проводят в исключительных случаях.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.
Материал для исследования. В лабораторию направляют кровь, гнойное отделяемое язв, носовые выделения, пунктат лимфатических узлов, гной из абсцессов; от убитых животных берут участки пораженной ткани легких, печени, селезенки, лимфатических узлов, носовой перегородки, трахеи, бронхов и др.
Микроскопия препаратов из исходного материала. В мазках из материала, окрашенных по Граму, возбудитель обнаруживают в виде прямых или слегка изогнутых, с закругленными концами грамотрицательных палочковидных бактерий размером (1,4...4) х 0,5 мкм, без спор и капсул (рис. 108). При окраске метиленовым синим Леффлера в клетках видна зернистость.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель сапа —аэроб, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6,8...7, лучше растет на средах с добавлением глицерина (2...4 %). Исследуемый материал высевают на глицеринизированных МПА и в МПБ. Рост возбудителя появляется на первые-вторые сутки, иногда позже.
В МПБ возбудитель растет с помутнением среды, на дне пробирки образуется серо-белый слизистый осадок, на поверхности бульона может появляться пленка. На МПА возбудитель формирует гладкие, полупрозрачные, серовато-белые, с перламутровым оттенком колонии, постепенно сливающиеся в слизистый налет. Из выросших культур делают мазки, окрашивают по Граму, при микроскопии обнаруживают грамотрицательные полиморфные палочки; в бульонных культурах клетки возбудителя короче — вплоть до кокковидных.
Характерным считают рост на глицериновом картофеле: через двое - трое суток появляются мелкие, полупрозрачные, с желтоватым оттенком колонии, которые затем сливаются в налет с желтоватым оттенком («медовым»), к шестому—восьмому дню цвет меняется до буро-коричневого или красноватого.
У бактерий с типичными для возбудителя сапа культурально-морфологическими свойствами изучают ферментативные признаки. P. mallei медленно, на 6...8-е сутки, свертывает молоко, разжижает желатину, расщепляет с образованием кислоты без газа глюкозу, лактозу, не утилизирует сахарозу, мальтозу, ман-нит. В странах тропической зоны Юго-Восточной Азии выделяют возбудителя «ложного сапа» (мелиоидоза, болезни Уитмора) — P. pseudomallei, вызывающего заболевание человека и животных. Для дифференциации P. mallei и P. pseudomallei используют признаки, указанные в таблице 32.
Биопроба. Готовят тканевую суспензию на стерильном физиологическом растворе (соотношение 1:10) и вводят в объеме 0,5... 1 мл подкожно в область шеи золотистым хомячкам или в объеме 3...5 мл морским свинкам. Стерильно взятым материалом (пунктат) заражают животных внутрибрюшинно. В положительных случаях на месте подкожной инъекции образуется язва с уплотненными краями, развивается конъюнктивит, ринит, у зараженных внутрибрюшинно самцов морских свинок — орхит (феномен Штрауса). Гибель хомячков наступает на 5...7-е сутки, морских свинок — на 8...15-е сутки или же болезнь переходит в хроническую форму. Павших и убитых животных подвергают бактериологическому исследованию.
Серологическая диагностика основана на результатах РСК. Диагностическим титром сыворотки считают разведение 1:10 при задержке гемолиза на четыре или три креста; задержку гемолиза на один, два креста при разведении сыворотки 1: 10 и на три, четыре креста при разведении сыворотки 1:5 оценивают как сомнительный результат.
Аллергическая диагностика. Метод, применяемый в хозяйствах для контроля за благополучием лошадей по сапу (ставят офтальмопробу или внутрикожную пробу с маллеином).
Биопрепараты. Маллеин — диагностический сапной аллерген. При его изготовлении выращивают культуру возбудителя в глицеринизированном бульоне в течение четырех месяцев, стерилизуют автоклавированием, фильтруют через фильтр Зейтца, контролируют на стерильность, безвредность на белых мышах, специфичность — на здоровых лошадях, стандартизуют по активности в единицах действия на лабораторных животных.
Сапной антиген для РСК готовят следующим образом: агаровую культуру возбудителя смывают фенолизированным физиологическим раствором, стерилизуют автоклавированием, отстаивают. В качестве антигена используют свободную от клеток культу-ральную жидкость, проверенную на стерильность, специфичность и активность.
Позитивная сапная сыворотка предназначена для определения активности антигена (РСК) и в качестве контроля при постановке РСК. Получают гипериммунизацией лошадей.
Мелиоидоз (ложный сап, болезнь Уитмора). Инфекционное заболевание животных (лошади, собаки, кролики, мелкий рогатый скот) и человека, протекающее в форме острой или хронической септицемии или септикопиемии.
Возбудитель — бактерия Pseudomonas pseudomallei, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.
Лабораторная диагностика мелиоидоза основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам.
Материал для исследования. В лабораторию направляют кровь, мокроту, мочу, гнойное отделяемое из абсцессов, участки пораженных органов.
Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель представляет собой полиморфную грамотрицательную палочку размером (1,5...6) х (9,5...10) мкм, с закругленными концами, спор и капсул нет; лофотрих. В мазках-отпечатках из органов располагается одиночно или компактными скоплениями.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель — аэроб, температурный оптимум 37 ºС, рН 6,8...7,0, к питательным средам нетребователен. Исследуемый материал высевают на агар и в бульон с глицерином. При загрязнении материала посторонней микрофлорой его обрабатывают пенициллином (1000 ЕД/мл).
На плотных средах через 24 ч инкубирования возбудитель формирует мелкие, прозрачные, позднее мутнеющие беловатые колонии с металлическим блеском, могут появляться колонии Я-формы и крупные (до 7 мм) М-формы. На кровяном агаре, глицеринизированных средах растет с образованием колоний кремово-оранжевого цвета. На жидких средах через 24....48 ч вызывает помутнение среды, образование пленки, которая после добавления нейтрального красного приобретает оранжево-красный цвет. Для бульонных культур характерен затхлый запах. Возбудитель в мазках из чистых культур располагается одиночно, парами, короткими цепочками или скоплениями по 5...7 штук.
У культур с типичными для P. pseudomallei культурально-морфологическими признаками исследуют ферментативные свойства. Возбудитель ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, дульцит; декстрин, не образует индол и сероводород, медленно разжижает желатину, свертывает и пептонизирует молоко, гидролизует аргинин.
Выделенные культуры также идентифицируют в серологических реакциях: РА, РНГА, РП.
Биопроба. Суспензией из материала заражают внутрибрюшинно (0,5... 1,0 мл) крыс и морских свинок. В положительных случаях животные погибают в зависимости от вирулентности штамма на 3...15-е сутки. У самцов морских свинок может развиться феномен Штрауса.
В качестве признаков для дифференциации P. mallei и P. pseudomallei используют морфологические критерии (см. табл.32), а также способность P.pseudomallei синтезировать на кровяном агаре кремово-оранжевый пигмент, пептонизировать молоко, гидролизировать желатину, при заражении вызывать гибель крыс.
Псевдомоноз норок. Остро протекающее инфекционное заболевание. Характеризуется геморрагической пневмонией, призна ками сепсиса. Кроме норок восприимчивы лисицы, песцы; у животных других видов возбудитель может служить причиной пневмоний, послеродовых, постхирургических осложнений.
Возбудитель псевдомоноза норок — бактерия Pseudomonas aeruginosa, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.
Лабораторная диагностика псевдомоноза норок основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам.
Материал для исследования. В лабораторию направляют пораженные участки легких, регионарные лимфатические узлы, селезенку, печень, почки.
Микроскопия препаратов из исходного материала. P. aeruginosa в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают в форме прямых или изогнутых грамотрицательных палочек длиной 0,5... 1,4 мкм, шириной 0,2...0,4 мкм, без капсул и спор; образует жгутики. Располагается в виде одиночных клеток, коротких цепочек.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель — аэроб, температурный оптимум 35...37 °С, к питательным средам нетребователен. Исследуемый материал высевают на МПА, в МПБ.
Через 24 ч рост P. aeruginosa в МПБ проявляется помутнением среды, образованием поверхностной пленки и серовато-белого осадка, за счет пигмента среда окрашена в сине-зеленый цвет, по мере старения культуры цвет колоний становится бурым. На МПА возбудитель формирует в основном два типа колоний: крупные (диаметр 2...5 мм), полупрозрачные, сероватые, гладкие, с плоскими краями и приподнятым центром, а также мелкие шероховатые. Штаммы, выделенные из респираторного и мочеполового тракта, могут образовывать слизистые колонии. Среда вокруг колоний окрашена за счет пигмента в сине-зеленый цвет. Возбудитель синтезирует четыре типа пигмента: пиоцианин (сине-зеленый или желто-зеленый), флуо-ресцеин, пиорубин и черно-бурый пигмент. Для культивирования P. aeruginosa при первичной изоляции из исследуемого материала используют специальные селективные среды с антибиотиками.
У выделенных культур изучают ферментативные свойства. Для P. aeruginosa характерны следующие признаки: образование аргининдигидролазы, оксидазы, гидролиз желатины, расщепление глюкозы, бета-аланина, D-, L-аспарагина, денитрификация и способность к росту при 4l °С.
Вид гетерогенен по соматическим О-антигенам. Для идентификации на уровне О-серогруппы используют РА на стекле, причем исследуют только культуры, у которых отмечены минимум два из трех физиологических признаков, характерных для вида: образование пигмента пиоцианина, расщепление глюкозы, рост при 41...42°С. Используют набор из трех поливалентных и одиннадцати моновалентных сывороток. Антигеном служит 18...20-часовая агаровая культура P. aeruginosa, инактивированная кипячением в водяной бане в течение 1,5 ч [концентрация (3...5)*109/мл]. Антиген первоначально исследуют с поливалентными сыворотками, при получении положительного результата — с моновалентными, входящими в состав той или иной поливалентной сыворотки. Результат учитывают через 3...6 мин.
Биопрепараты. Моновалентную формолквасцовую вакцину против псевдомоноза норок готовят следующим образом: культуру вакцинного штамма (Шестой серотип) выращивают на питательной среде, инактивируют формалином, адсорбируют на квасцах, контролируют на стерильность, безвредность, активность.
Диагностические О-агглютинирующие сыворотки для серо-групповой идентификации P. aeruginosa включают в себя три поливалентные сыворотки: № 1 (03, 04, 05, 06, 07), № 2 (02, 08, 09), № 3 (010, 011, 012) и одиннадцать соответствующих моновалентных сывороток. Предназначены для идентификации P. aeruginosa на уровне О-серогруппы.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Ознакомиться с биопрепаратами для серологической и аллергической диагностики сапа.
2. Изучить морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства P. aeruginosa.
3. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической профилактики и диагностики псевдомоноза норок.
Контрольные вопросы
1. Каково значение бактериологического исследования для лабораторной диагностики сапа?
2. Какие иммунологические методы применяют для диагностики сапа?
3. Каковы биологические свойства возбудителя псевдомоноза норок?
4. Какие биопрепараты применяют для специфической профилактики псевдомоноза норок и серологической идентификации возбудителя?
5. В чем заключается бактериологическое исследование на мелиоидоз?
Дата добавления: 2014-12-12 | Просмотры: 1559 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 |
|