АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Посев на питательные среды

Подготовленный материал для исследования засевают на чашки Петри с питательным агаром. Используют мясо-пептонный агар, агар Хоттингера или дифференциально-диагностическую среду. Для засева одной пробы желательно использовать 5-10 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Посев необходимо производить с помощью шпателя, предварительно нанося на поверхность агара 1-2 капли исследуемого материала. Если материал значительно загрязнён посторонней микрофлорой (почва, корма, смывы с поверхностей и пр.) делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки.

При исследовании материала, мало загрязнённого посторонней микрофлорой (кровь, пунктаты из карбункула, органы биопробных животных), посев можно проводить петлёй без истощения, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и МПБ. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 18-20ч.

На следующий день посевы просматривают не только визуально, но и под малым увеличением микроскопа. На чашках, кроме сибиреязвенного микроба, наблюдается рост и других спорообразующих микробов-сапрофитов, морфологически трудно отличимых от B.anthracis. Для сибиреязвенного микроба характерно образование крупных, шероховатых, матовых колоний, край которых напоминает локоны волос или «львиную гриву». Колонии B. anthracis вырастают и трудно снимаются петлёй с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для идентификации с питательного агара отбирают не менее 10 колоний шероховатых, при отсутствии такого количества – все шероховатые колонии.

Посевы на дифференциально-диагностической среде, содержащей 0,01% фенолфталеин фосфата, перед просмотром обрабатывают парами аммиака. В силу того, что сибиреязвенный микроб не образует фосфатазу, его колонии не изменяют своего цвета. Колонии спорообразующих сапрофитов, в том числе и B.cereus под действием паров аммиака приобретают розовый или красный цвет. С дифференциально-диагностической среды для идентификации отбирают визуально и с помощью микроскопа при малом увеличении все колонии, не изменившие своего цвета после обработки парами аммиака.

Из отобранных колоний делают мазки на 2 или более предметных стекла. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами – по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной соматической люминесцентной сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками – специфическое свечение на 4+ или 3+. Для дальнейшей идентификации отбирают только те колонии, которые состоят из характерных для сибиреязвенного микроба палочек.

По возможности, из этих же колоний делают посевы: на дифференциально-диагностическую среду или кровяной агар, на МПБ, если колонии расположены изолированно и не соприкасаются с колониями посторонних микробов, и на скошенный агар. На чашки с питательным агаром посев производят секторами. Посевы ставят в термостат на 18-20ч., после чего производят отбор и учёт колоний для дальнейшей идентификации.

Отбирают колонии, которые при росте на кровяном агаре не дают гемолиза бараньих эритроцитов, не изменяют своего цвета после обработки парами аммиака, формируют характерный «комочек ваты» на дне пробирки при выращивании на МПБ.

Идентификацию выделенной культуры проводят на основании следующих признаков: 1) тест с сибиреязвенным бактериофагом. Сибиреязвенный микроб лизируется сибиреязвенными фагами («Гамма», Кадр). 2) Наличие капсулы выявляют путём посева культур на 1% бикарбонатный агар или среду ГКИ. Инкубацию на 1% бикарбонатном агаре проводят при 37°С в анаэростатах при содержании 10-50% CO₂ или в эксикаторе с притёртой крышкой. Капсулообразующие культуры вырастают в виде крупных слизистых колоний. В мазках, окрашенных после их фиксации одним из методов (по Ребигеру, капсульно-соматической сибиреязвенной люминесцентной сывороткой), видны цепочки палочек, окружённых хорошо выраженной капсулой.

3) Тест «Жемчужного ожерелья». Перед постановкой пробы остуженный до 45°С 2% питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробирки. В первую добавляют пенициллин из расчёта 0,5 ед/мл, вторую – 0,05 ед/мл, третья – без антибиотика (контроль). Содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри. После застывания среды дно чашек снаружи размечают на квадраты или кружки, на которых пишут номера анализа. На обозначенные участки наносят по одной капле изучаемых 3-6-часовых бульонных культур. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Посевы инкубируют при 37°С. Не позже 3ч просматривают рост с сухой (x40) и иммерсионной (x90) фазовоконтрастными системами под микроскопом, предварительно накрыв каждый отмеченный участок покровным стеклом. На среде, содержащей пенициллин, видны шарообразные формы бактериальных клеток, расположенных в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга.

4) Подвижность. Сибиреязвенный микроб неподвижен, чем отличается от большинства спорообразующих сапрофитов.

5) Гемолиз эритроцитов барана. Для проведения этого теста готовят МПА или агар Хоттингера с 3-5% дефибринированной крови барана (pH 7,2-7,3). Посевы лучше делать петлёй секторами. Выдерживают в термостате при 37°С в течение 18-20ч, после чего учитывают результат. В эти сроки сибиреязвенный микроб не даёт гемолиза эритроцитов барана в отличие от родственных спорообразующих сапрофитов, образующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний.

6) Тест на лецитиназу. Засевают культуру в жидкую желточную среду или на агар Хоттингера, в который добавлен стерильно желток куриного яйца, и инкубируют в термостате при 37°С. Возбудитель сибирской язвы, как правило, в течение нескольких суток инкубирования не свёртывает желток, в то время как представители спорообразующих сапрофитов свёртывают желток уже в первые сутки. На плотной питательной среде с желтком сибиреязвенный микроб растёт, не образуя вокруг колоний мутной белой зоны. Вокруг колоний большинства сапрофитов, вырабатывающих активную лецитиназу, просматривается широкая мутно-белая зона.

7) Характер роста на МПБ - сибиреязвенный микроб даёт рост в виде комочка, трудно разбивающегося при встряхивании, а сапрофиты легко мутят бульон.

Дата добавления: 2015-09-18 | Просмотры: 911 | Нарушение авторских прав