 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Г. Реакция нейтрализации на чашках Петри (определение токсигенности культур бактерий in vitro)На середину чашки Петри с фосфатно-пептонным агаром помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой, содержащей в 1 мл 500 АЕ. Исследуемую культуру засевают штрихами, перпендикулярными к фильтровальной бумаге, или бляшками диаметром 1 см на расстоянии 1 см от края полоски. Одна культура должна быть заведомо токсигенной (контроль). Посевы помещают в термостат. Если культура токсигенна, то на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитации, аналогичные линиям преципитата контрольной (рис.13)
þ РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА (РЛ) Реакцией лизиса называется растворение антигена, соединенного с антителами, в присутствии комплемета. В зависимости от антигенов, участвующих в реакции лизиса, она может называться реакцией бактериолиза, спирохетолиза, гемолиза и т.д.. Система комплемента - комплекс белков сыворотки крови, реагирующих между собой в определенной последовательности и играющие важную роль в поддержании гомеостаза. В организме комплемент находится в неактивном состоянии. Существуют два пути активации комплемента – классический и альтернативный. При классическом пути инициирующим фактором является образование комплекса АГ+АТ. При реализации альтернативного пути процесс начинается в результате прямого действия антигена (например, полисахарида микробной клетки). Как при классическом, так и при альтернативном пути активации комплемента на конечной стадии образуется комплекс из компонентов комплемента С6, С7, С8, С9, называющийся мембраноатакующим. Этот комплекс вызывает лизис клетки в основе которого лежит необратимое повреждение структур ее мембраны.
þ РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА Реакция бактериолиза не нашла широкого применения в лабораторной практике из-за того, что большинство микроорганизмов, за исключением холерного вибриона и трепонем, устойчивы к литическому действию антител. Данная реакция используется для обнаружения в сыворотке больного специфических антител к возбудителю холеры. ð Ингредиенты: 1. Сыворотка крови больного (содержит определенную концентрацию бактерицидных антител, например, против холерных вибрионов). 2. Антиген - взвесь живых холерных вибрионов. 3. Комплемент. Сыворотку крови больного нагревают в течение 30 минут при температуре 56°С для инактивации в ней комплемента. Взвесь микробов готовят из их суточной культуры (1 млрд. клеток в 1 мл). В пробирки к последовательным разведениям исследуемой сыворотки добавляют взвесь микробов и неразведенный комплемент. Ставят контроль инактивации комплемента - в пробирку вносят исследуемую сыворотку и взвесь микробов, а так же контроль комплемента на наличие в нем лизинов - в пробирку вносят изотонический раствор хлорида натрия вместо сыворотки и взвесь микробов. Пробирки помещают на 2 часа в термостат при 37°С. Если в сыворотке больного содержались антитела против холерных вибрионов, происходит активация комплемента по классическому пути, приводящее к лизису микробных клеток. Для обнаружения лизиса делают высев петлей из каждой пробирки на чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в течение суток и определяют титр антител. Высевы из тех разведений, где содержалось достаточное для активации комплемента количество антител остаются стерильными. Титром является наибольшее разведение сыворотки, которое еще дает лизис бактерий (рис.14) Одной из разновидностей реакции бактериолиза является феномен Исаева-Пфейфера, применяющийся для обнаружения холерного вибриона в исследуемом материале.Исследование проводится на двух морских свинках. Первой (подопытной) внутрибрюшинно вводят смесь, состоящую из 1 мл питательного бульона, одной петли исследуемой культуры холерного вибриона и 0,2 мл холерной сыворотки в разведении 1:100. Второй свинке (контрольной) вводят смесь, содержащую 1 мл питательного бульона, 1 петлю исследуемой культуры и 0,2 мл нормальной сыворотки. Через каждые 20 минут у животных берут перитонеальную жидкость из которой делают мазки и препараты "висячая капля". Если изучаемый вибрион является холерным, то в препаратах, полученных от подопытной свинки наблюдаются следуюющие изменения: сначала у вибрионов прекращается подвижность, затем появляется овальные клетки, потом шарообразные и, наконец, наступает растворение их. Подобные изменения обусловлены тем, что происходит активация собственного комплемента морской свинки комплексом АГ (холерный вибрион) + АТ (холерная сыворотка). У контрольной свинки вибрионы не изменяются, что связано с отсутствием в ее организме специфических антимикробных антител. В дальнейшем контрольное животное погибает, а подопытное остается живым.
þ РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) Реакция связывания комплемента основывается на реакции гемолиза. Относится к сложным серологическим реакциям, однако не смотря на сложность, является чувствительной и специфической. РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену, а также для определения антигена по известным антителам. С помощью РСК обнаруживают антитела в сыворотке больных сифилисом, сапом, риккетсиозами, вирусными заболеваниями. Для проведения РСК необходимы 2 системы: ð 1-ая система: - антитело - антиген - комплемент ð 2-я система(гемолитическая): - эритроциты барана - гемолитическая сыворотка. Специфичное взаимодействие антигена и антитела сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку, этот процесс не проявляется визуально, используют индикатор - гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает: произошла фиксация комплемента комплексом АГ+АТ. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит (рис.15). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз (рис.16). ð Характеристика ингредиентов: 1. Антитело Берется сыворотка больного или диагностическая сыворотка, которая прогревается на водяной бане при 56°С в течение 30 минут для инактивации ее собственного комплемента.
Некоторые сыворотки обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность сывороток устраняют следующими способами: 1) обработка сыворотки углекислым газом; 2) прогревание сыворотки при 56-58°С; 3) однократное замораживание при -20 С или при -70°С с удалением осадка центрифугированием; 4) добавление комплемента к сыворотке в соотношении 1:10; 5) прогревание сыворотки после инкубации на холоде в течение 18-20 часов.
2. Антиген В качестве антигенов для РСК используются культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, компоненты патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы. Антигены также могут обладать антикомплементарностью, которую устраняют следующими способами: 1) термолиз - многократное замораживание и оттаивание; 2) обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами. 3. Комплемент В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом. Также можно применять сухой комплемент. Чтобы получить основной раствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоническим раствором хлорида натрия. 4. Эритроциты барана Их используют в виде 3% взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стеклянную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 минут и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза в изотоническом растворе натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. 5. Гемолитическая сыворотка Гемолитическую сыворотку получают следующим образом. Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50 % взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Ее титр сыворотки оказывается не ниже 1:1200, делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при 56°С. Для предупреждения бактериального роста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10 000 или 1 % борную кислоту).
Гемолитическая система Состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 % взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при 37 С. ð Проведение основного опыта РСК Для проведения основного опыта РСК необходимы 3 пробирки, в которые вносятся следующие ингредиенты: пробирка N1: сыворотка в соответствующем разведении + АГ + комплемент; пробирка N2 (контроль сыворотки): сыворотка в соответствующем разведении + комплемент + изотонический раствор хлорида натрия; пробирка N3 (контроль АГ): АГ + комплемент + изотонический раствор хлорида натрия. Затем во все пробирки (1-я система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (2-я система). После тщательного смешивания пробирки помещают в термостат на 1 час при 37°С. Результат учитывают предварительно после извлечения пробирок из термостата, окончательно - после 15-18 часов инкубации в холодильнике или при комнатной температуре. ð Результат реакции выражают в плюсах: (++++) - резко положительная реакция (полная задержка гемолиза - жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно). (+++) - положительная реакция (гемолизу подвергаются 25 % эритроцитов, что проявляется желтым или бледно - розовым окрашиванием жидкости над осадком эритроцитов). (++) - сомнительная реакция (гемолизу подвергаются 50 % эритроцитов, что проявляется розовым окрашиванием жидкости над осадком эритроцитов). (+) - очень сомнительная реакция (гемолизу подвергаются 75 % эритроцитов, что проявляется интенсивной розовой окраской надосадочной жидкости и незначительным количеством количеством эритроцитов в осадке). (-) - отрицательная реакция (гемолизу подвергаются все эритроциты, что сопровождается феноменом "лаковая кровь").
þ РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ) РИФ представляет собой взаимодействие люминесцирующих антител с корпускулярным антигеном с образованием светящегося иммунного комплекса. В основе лежит способность иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (флюоресцинизотиоцианатом (ФИТЦ), акридиновым оранжевым) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию, которая выявляется при помоци специального люминесцентного микроскопа. ð Разновидности РИФ: Дата добавления: 2015-07-23 | Просмотры: 1551 | Нарушение авторских прав |
