АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Принцип метода

ПЦР – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) in vitro специфической последовательности ДНК возбудителя. Копирование ДНК осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой. ДНК – полимераза способна непрерывно связывать нуклеотиды (тимин, аденин, цитозин, гуанин), двигаясь по направлению от 5` к 3` концу[3] по одиночной цепи ДНК и синтезируя комплементарную ей последовательность ДНК. В течение нескольких часов можно размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающую исходную в 10⁸-10¹² раз.

Однако ДНК-полимераза не может начать синтез ДНК с «нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, на которой она может присоединять нуклеотиды. Короткие фрагменты затравочной ДНК, состоящие из 20-30 нуклеотидов, называются «праймерами». Праймеры «узнают» строго определенный участок ДНК и связываются с ним по принципу молекулярной комплементарности. В обычной ПЦР используется пара «праймеров», которые ограничивают («фланкируют») амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Причем праймеры фланкируют не любой, а строго специфичный для определенного вида возбудителя участок.

Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужно, чтобы реакция протекала циклично. Как правило каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из 3 этапов:

1. Денатурация или «плавление» ДНК, когда 2-х цепочесная ДНК под действием высокой температуры (94-95°С – сначала 60 мин., потом 15 мин.) переходит в одноцепочечное состояние.

2. Связывание (отжиг) праймеров с комплементарными последовательностями матричной ДНК при 40-60°С. Температура зависит от длины праймеров и последовательности оснований..

3. Элонгация (удлинение цепи), т.е. достройка полипептидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75°С.

4. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности. В результате этого происходит экспоненциальное увеличение количества копий по формуле 2ⁿ, где n – число прошедших циклов амплификации. Продолжительность одного цикла составляет в среднем 3 минуты, т.о. через 2 часа можно получить около 1 миллиарда копий определенной последовательности.

Процесс амплификации идетэффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу. Наиболее часто используется Taq–полимераза (фермент полученный из штамма бактерий Termus aquaticus, выделенный из горячих источников. Оптимальная температура действия Taq–полимеразы 72°С, но она работает даже при 94-95°С (т.е. при температуре при которой проводится денатурация). Кроме того к достоинствам данной полимеразы можно отнести то, что она не требует замены после каждого цикла.

5. Детекция продуктов реакции. Существует несколько способов детекции.

а) метод калориметрии - если праймеры несут метку (например биотин – авидин – пероксидазный комплекс), то детекция проводится по наличию цветной реакции, которая развивается после добавления соответствующего субстрата;

б) метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем специфичным к ДНК (бромистый этидий) и анализом в УФ-области спектра;

в) метод молекулярной гибридизации.

Схема ПЦР приводится на рис.21.

ð Преимущества ПЦР

1. Скорость, высокая производительность. Постановка ПЦР занимает 6-8 часов.

2. Высокая специфичность, что определяется уникальностью генетического материала каждого живого организма.

3. Высокая чувствительность. Теоретически достаточно 1 копии ДНК в исследуемом материале. Если в качестве мишени используется фрагмент

ДНК представленный большим количеством копий в геноме возбудителя, то ПЦР позволяет обнаружить менее 1 микроба в образце (т.е. фрагмент ДНК лизированной микробной клетки). Т.о. чувствительность ПЦР составляет 0,5-1 микроорганизма на пробу, что позволяет ее использовать даже в тех случаях, когда серологическое и бактериологическое исследование не дают положительного результата вследствие крайне малого микробного титра.

4. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один и тот же набор приборов и незначительно различающиеся наборы реактивов нуклеиновых кислот разных видов микробов.

5. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации персонала.

6. ПЦР позволяет избежать проблем связанных с перекрестно реагирующими антигенами.

7. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних этапах болезни, когда лечение наиболее эффективно.

8. Возможность диагностики одновременно нескольких возбудителей заболеваний в одной пробе.

ð Недостатки ПЦР

В то же время высокая чувствительность ПЦР одновременно является ее уязвимым местом. Этот парадокс известен как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению посторонними молекулами ДНК, которые могут стать мишенью для праймеров. В этом случае возможны ложноположительные результаты. Для решения данной проблемы могут быть использованы следующие подходы:

- пространственное распределение территории на 3 блока: подготовка образца, амплификация, электрофорез и детекция;

- раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах;

- использование одноразовых пластиковых материалов;

- регулярная обработка помещений лаборатории УФЛ;

Чувствительность ПЦР может быть снижена из-за наличия в исследуемых образцах крови, мочи, ингибиторов. Кроме того, возможны определенные сложности при выявлении в образце сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов.

Список литературы

Медицинские лабораторные технологии (в 2-х томах). Под редакцией А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург. "Интермедика". 1999.

О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. Под редакцией В.И. Покровского. - Москва. ГЭОТАР - МЕД. 2001.

Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн. Полимеразная цепная реакция в клиниче-ской микробиологической диагностике. Клиническая микробиология и анти-микробная химиотерапия. Том 2 №3 - 2000.

Manual of allergy and immunology. Edited by Glen J. Lawlor, Jr. Thomas J. Fischer, Daniel C. Adelman. - London. 1995.

К.Д. Пяткин, Н.С. Маркова, Н.Д. Трофимова. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. - М. "Медицина". 1969.

Иммунологические методы. Под редакцией Г. Фримеля.- М. «Медицина». 1987.

Практическая иммунология. Под редакцией П.Н. Буртасова и И.С. Безденежных.- М. «Медицина». 1969.

ОГЛАВЛЕНИЕ

[1] Известно несколько генотипов вируса гепатита В, а генотип коррелирует с тяжестью течения болезни и с эффективностью действия препаратов для лечения.

[2] Целесообразно применять в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы невозможно применить, напимер у M. tuberculosis.

[3] На одном конце находится фосфатная группа в положении 5`, на другом свободная гидроксильная группа в положении 3`.

Дата добавления: 2015-07-23 | Просмотры: 658 | Нарушение авторских прав