АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Принцип метода

Прочитайте:
  1. A. к принципам, обусловленным действием рыночной среды
  2. A. метода разбивки по компонентам
  3. A. принцип соответствия
  4. A. принципы полезности, замещения, ожидания
  5. I. Общие принципы организации работы поликлиники
  6. I. Общий принцип строения
  7. I. Принцип «не навреди» (модель Гиппократа).
  8. I. Скелетная мышечная ткань: локализация и принцип строения
  9. II. Принцип «делай благо» (модель Парацельса).
  10. II. Этиологический принцип

ПЦР – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) in vitro специфической последовательности ДНК возбудителя. Копирование ДНК осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой. ДНК – полимераза способна непрерывно связывать нуклеотиды (тимин, аденин, цитозин, гуанин), двигаясь по направлению от 5` к 3` концу[3] по одиночной цепи ДНК и синтезируя комплементарную ей последовательность ДНК. В течение нескольких часов можно размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающую исходную в 108-1012 раз.

Однако ДНК-полимераза не может начать синтез ДНК с «нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, на которой она может присоединять нуклеотиды. Короткие фрагменты затравочной ДНК, состоящие из 20-30 нуклеотидов, называются «праймерами». Праймеры «узнают» строго определенный участок ДНК и связываются с ним по принципу молекулярной комплементарности. В обычной ПЦР используется пара «праймеров», которые ограничивают («фланкируют») амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Причем праймеры фланкируют не любой, а строго специфичный для определенного вида возбудителя участок.

Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужно, чтобы реакция протекала циклично. Как правило каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из 3 этапов:

1. Денатурация или «плавление» ДНК, когда 2-х цепочесная ДНК под действием высокой температуры (94-95°С – сначала 60 мин., потом 15 мин.) переходит в одноцепочечное состояние.

2. Связывание (отжиг) праймеров с комплементарными последовательностями матричной ДНК при 40-60°С. Температура зависит от длины праймеров и последовательности оснований..

3. Элонгация (удлинение цепи), т.е. достройка полипептидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75°С.

4. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности. В результате этого происходит экспоненциальное увеличение количества копий по формуле 2n, где n – число прошедших циклов амплификации. Продолжительность одного цикла составляет в среднем 3 минуты, т.о. через 2 часа можно получить около 1 миллиарда копий определенной последовательности.

Процесс амплификации идетэффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу. Наиболее часто используется Taq–полимераза (фермент полученный из штамма бактерий Termus aquaticus, выделенный из горячих источников. Оптимальная температура действия Taq–полимеразы 72°С, но она работает даже при 94-95°С (т.е. при температуре при которой проводится денатурация). Кроме того к достоинствам данной полимеразы можно отнести то, что она не требует замены после каждого цикла.

5. Детекция продуктов реакции. Существует несколько способов детекции.

а) метод калориметрии - если праймеры несут метку (например биотин – авидин – пероксидазный комплекс), то детекция проводится по наличию цветной реакции, которая развивается после добавления соответствующего субстрата;

б) метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем специфичным к ДНК (бромистый этидий) и анализом в УФ-области спектра;

в) метод молекулярной гибридизации.

Схема ПЦР приводится на рис.21.

ð Преимущества ПЦР

1. Скорость, высокая производительность. Постановка ПЦР занимает 6-8 часов.

2. Высокая специфичность, что определяется уникальностью генетического материала каждого живого организма.

3. Высокая чувствительность. Теоретически достаточно 1 копии ДНК в исследуемом материале. Если в качестве мишени используется фрагмент

ДНК представленный большим количеством копий в геноме возбудителя, то ПЦР позволяет обнаружить менее 1 микроба в образце (т.е. фрагмент ДНК лизированной микробной клетки). Т.о. чувствительность ПЦР составляет 0,5-1 микроорганизма на пробу, что позволяет ее использовать даже в тех случаях, когда серологическое и бактериологическое исследование не дают положительного результата вследствие крайне малого микробного титра.

4. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один и тот же набор приборов и незначительно различающиеся наборы реактивов нуклеиновых кислот разных видов микробов.

5. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации персонала.

6. ПЦР позволяет избежать проблем связанных с перекрестно реагирующими антигенами.

7. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних этапах болезни, когда лечение наиболее эффективно.

8. Возможность диагностики одновременно нескольких возбудителей заболеваний в одной пробе.

 
 
Рис.21

 


ð Недостатки ПЦР

В то же время высокая чувствительность ПЦР одновременно является ее уязвимым местом. Этот парадокс известен как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению посторонними молекулами ДНК, которые могут стать мишенью для праймеров. В этом случае возможны ложноположительные результаты. Для решения данной проблемы могут быть использованы следующие подходы:

- пространственное распределение территории на 3 блока: подготовка образца, амплификация, электрофорез и детекция;

- раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах;

- использование одноразовых пластиковых материалов;

- регулярная обработка помещений лаборатории УФЛ;

Чувствительность ПЦР может быть снижена из-за наличия в исследуемых образцах крови, мочи, ингибиторов. Кроме того, возможны определенные сложности при выявлении в образце сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов.

 

Список литературы

 

Медицинские лабораторные технологии (в 2-х томах). Под редакцией А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург. "Интермедика". 1999.

 

О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. Под редакцией В.И. Покровского. - Москва. ГЭОТАР - МЕД. 2001.

 

Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн. Полимеразная цепная реакция в клиниче-ской микробиологической диагностике. Клиническая микробиология и анти-микробная химиотерапия. Том 2 №3 - 2000.

 

Manual of allergy and immunology. Edited by Glen J. Lawlor, Jr. Thomas J. Fischer, Daniel C. Adelman. - London. 1995.

 

К.Д. Пяткин, Н.С. Маркова, Н.Д. Трофимова. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. - М. "Медицина". 1969.

 

Иммунологические методы. Под редакцией Г. Фримеля.- М. «Медицина». 1987.

 

Практическая иммунология. Под редакцией П.Н. Буртасова и И.С. Безденежных.- М. «Медицина». 1969.

 

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

Понятие о реакциях иммунитета ……………………………………………………... Диагностические препараты …………………………………………………………..  
 
Основные разновидности реакций иммунитета ……………………………………  
  Реакция агглютинации (РА) ……………………………………………………….  
  Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) …………………..  
  Реакция преципитации (РП)…………………………………………………….....  
  Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН)……………………....  
  Реакция лизиса ………………………………………………………………………  
  Реакция бактериолиза ……………………………………………………………...  
  Реакция связывания комплемента (РСК)……………………………………......  
  Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)……………………………………….....  
  Иммуноферментный анализ (ИФА)………………………………………………  
  Иммуноблоттинг ……………………………………………………………………  
  Полимеразная цепная реакция (ПЦР)………………………………………….....  
Список литературы ……………………………………………………………………...  
Оглавление ……………………………………………………………………………….  
 
 

 


[1] Известно несколько генотипов вируса гепатита В, а генотип коррелирует с тяжестью течения болезни и с эффективностью действия препаратов для лечения.

[2] Целесообразно применять в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы невозможно применить, напимер у M. tuberculosis.

[3] На одном конце находится фосфатная группа в положении 5`, на другом свободная гидроксильная группа в положении 3`.


Дата добавления: 2015-07-23 | Просмотры: 710 | Нарушение авторских прав



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |



При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.006 сек.)