АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Непрямой метод Кунса

На стекло с антигенсодержащим материалом наносят обычную кроличью антимикробную сыворотку, содержащую антитела, которые образуют с микробной клеткой неви­димый комплекс. Затем препарат промывают для удаления излишков сыворотки и обрабатывают ослиной или лошадиной антикроличьей сывороткой с люминесцирующими антителами против кроличьего белка. (Эту сыворотку получают путем гипериммунизации ослов или лошадей кроличьими иммуногло­булинами). В результате образуется двойной светящийся комплекс (рис. 18).

Данная методика является более экономически выгодной, т.к. не зависимо от вида микроба используется всего одна универсальная антикроличья сыворотка, меченная флюорохромами.

ð Оценка результатов исследования.

Степень яркости люминесценции бактерий обозначают в плюсах:

(++++) - яркая флюоресценция микробной клетки с четко выраженным ободком по периферии (специфичес­кое свечение).

(+++) - умеренная флюоресценция микробной клетки с четко выраженным ободком по периферии (специфи­ческое свечение).

(++) или (+) - слабая равномерная флюоресценция микробной клетки без выраженного ободка (неспецифичес­кое свечение).

Обнаружение светящегося ореола у 2-5 клеток в поле зрения свидетельствует о наличии в исследуемом материале микроба.

þ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

ИФА представляет собой реакцию иммунитета, в которой используются антитела или антигены, связанные с каким-либо ферментом. В результате образуется иммунный комплекс, маркированный ферментом. Этот комплекс выявляется цветной реакцией при добавлении соответствующего хромогенного субстрата, изменяющего окраску при взаимодействии с ферментом.

По сравнению с классическими методами ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена и антитела в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность.

ð Методы проведения ИФА.

1. Определение антигенов в исследуемом материале (сэндвич - метод) (рис.19 а)

1. Сорбция известных антител на поверхности лунок полистироловой пластинки.

2. Отмывка неадсорбировавшихся антител.

3. Внесение в лунки планшета антигенсодержащего материала. Если антитела соответствуют антигену происходит образование невидимого комплекса АГ+АТ.

4. Отмывка несвязавшихся с антителами антигенов.

5. Добавление в лунки соответствующих антител, меченных пероксидазой хрена или другим ферментом. При этом происходит связывание меченных ферментом антител с имеющимся комплексом АГ+АТ.

6. Отмывка несвязавшихся антител, меченных ферментом.

7. Добавление хромогенного субстрата (5-аминосалициловая кислота с перекисью водорода).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность кото­рого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунный комплекс. Учет результатов производят при помощи специальных сканеров, позволяющих регистрировать незначительное изменение окраски субстрата.

2. Определение неизвестных антител в сыворотке больного (рис. 19 б)

1. Сорбция на поверхности лунок известного антигена.

2. Отмывка неадсорбировавшихся антигенов.

3. Внесение в лунки исследуемой сыворотки крови, содержащей антитела. Если антитела соответствуют антигену происходит образование невидимого комплекса АГ+АТ.

4. Отмывка несвязавшихся с антигенами антител.

5. Внесение в лунки меченной ферментом античеловеческой сыворотки (сыворотки с антителами против иммуноглобулинов человека). При этом происходит связывание меченных ферментом антител с имеющимся комплексом АГ+АТ.

6. Отмывка несвязавшихся антител, меченных ферментом

7. Добавление хромогенного субстрата.

þ ИММУНОБЛОТTИНГ

Иммуноблоттинг применяется на практике для обнаружения в сыворотке больного антител к ВИЧ после первичного положительного результата ИФА. Иммуноблоттинг является более специфичным методом ввиду того, что из реакции исключаются перекрестно-реагирующие антигены ВИЧ. Первоначально растворимые белки возбудителя экстрагируют и разделяют на отдельные фракции при помощи электрофореза в полиакриловом геле (на практике данную процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на гель накладывается нитроцеллюлозная пленка или активированная бумага. Электрофорез продолжают, при этом происходит перенос полос преципитата из геля на носитель (пленку или бумагу).

По окончании электрофореза на носитель наносится сыворотка пациента и инкубируется. Несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием и проводят ИФА. При этом на носитель наслаивают антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплекса АГ+АТ+антисыворотка на носителе появляются окрашенные полоски. Схема иммуноблоттинга приводится на рис.20.

þ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

ПЦР относится к реакциям нового направления в диагностике инфекционных и наследственных заболеваний - ДНК-диагностике или генодиагностике. Метод был предложен в 1985 г. американцем Кэри Муллисом.

ð Области применения:

1. В биологии для изучения механизмов дифференциации клеток, экспрессии генов на разных этапах развития организма в норме и патологии.

2. В пренатальной диагностике наследственных заболований.

3. Для установления пола ребенка и отцовства.

4. В иммунологии для определения генов, контролирующих синтез тех или иных соединений в ходе иммунного ответа; для определения совместимости тканей при пересадке.

5. В онкологии при диагностике вируса папилломы, некоторые штаммы которого ассоциируются с раком шейки матки и другими разновидностями рака.

6. В криминалистике для идентификации личности.

7. Диагностика и мониторинг инфекционных заболеваний:

- диагностика туберкулеза, дифференциация туберкулеза и заболеваний легких нетуберкулезной этиологии, прогнозирование возможных рецидивов туберкулеза, определение целесообразности назначения химиотерапии в различных группах больных, осуществление эпидемиологического контроля за бактериовыделителями;

- диагностика дифтерии, выявление токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae.

- диагностика парентеральных гепатитов, контроль эффективности лечения гепатита В, мониторинг распространения вирусного гепатита В, генотипирование вируса гепатита В[1];

- определение чувствительности микробов к антибиотикам[2].

Дата добавления: 2015-07-23 | Просмотры: 1083 | Нарушение авторских прав