АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Светооптическая микроскопия

Для световой микроскопии применяют микроскоп — оптический прибор, позволяющий наблюдать мелкие объекты (рис. 11 – 1). Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создаёт изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом. Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разрешение можно повысить за счёт увеличения апертуры оптической системы, например, путём увеличения коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха (n = 1,0), при микроскопировании применяют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную. Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–01

Рис. 11 – 1. Схема светового микроскопа. Пояснения в тексте.

Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашеного материала. Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют соответствующей системой (например, «ОИ-10» или «ОИ-21»). Препарат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи (рис. 11 – 2). В качестве иммерсионной жидкости пригодно вазелиновое масло.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–02

Рис. 11 – 2. Схема светового микроскопа с темнопольным конденсором. Пояснения в тексте.

Фазово - контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашеные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашеные — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной (рис. 11 – 3) и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсионные объективы-апохроматы.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–03

Рис. 11 – 3. Схема фазово - контрастного микроскопа. Пояснения в тексте.

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашеных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашеных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой — мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.

Люминесцентная микроскопия. Метод основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11 – 4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра. Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью АТ или лектинов, помеченных флюорохромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями АТ с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11 – 5 и 11 – 6.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–04.

Рис. 11 – 4. Схема люминесцентного микроскопа. Пояснения в тексте.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–05

Рис. 11 – 5. Прямая иммунофлюоресценция. Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем АТ к интересующему Аг; АТ взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–06.

Рис. 11 – 6. Непрямая иммунофлюоресценция. Непрямой метод предполагает использование двух различных АТ. Первые АТ реагируют с Аг микроорганизма, вторые АТ (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми АТ, являющимися Аг ко вторым АТ. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых АТ связывается несколько молекул вторых АТ.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1087 | Нарушение авторских прав