АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Люминесцентная микроскопия.

Люминесценцией (lumen — свет, escent — слабое действие) называется свечение объекта, возбуждае­мое поглощенной им световой энергией. Возбуждать люминесцен­цию можно как ультрафиолетовым излучением, так и коротковол­новым излучением видимой части спектра — сине-фиолетовым. При этом может возникать люминесценция в цветовой гамме види­мого спектра, что дает цветное светящееся изображение. Если объект сам не дает явления люминесценции, его подкрашивают специальными красителями — флуорохромами (акридин оранже­вый, корифосфин, тиофлавин и др.).

Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа (рис. 9). Непосредственно между источником света и зеркалом микроскопа устанавливают сине-фиолетовый светофильтр, а на окуляр микроскопа — желтый светофильтр. Сине-фиолетовый свет, попав на препарат, возбуждает в последнем люминесцен­цию. Для того чтобы ее увидеть, необходимо убрать все сине-фиолетовые лучи, что и осуществляет желтый фильтр на окуляре, от­секающий коротковолновую часть спектра и пропускающий в глаз наблюдателя длинноволновый свет флуоресценции.

Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены лю­минесцентными микроскопами серий МЛ и «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследова­тельского типа).

Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люми-ногены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильный низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо- и рентге-нолюми несценцию.

В лабораторной практике в основном используют фотолюми­несценцию — свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковре­менную — флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресцен­цию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света воз­буждения большей длиной волны, поэтому при освещении объек­та невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиоле­товыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хо­рошо видимые простым глазом.

Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первич­ная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. Флуорох-ромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при ос­вещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами — вто­ричная люминесценция.

В люминесцентных микроскопах источником возбуждения служит ртутно-кварцевая лампа ДРТ-250. Для успешной люми­несцентной микроскопии необходимо: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделить коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и от­сечь лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят свето­фильтры (возбуждающие) УФС-3, ФС-1, СС-4 и др.; 2) из свето-воТо потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропустить длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно за­щитить глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя по­мешают окулярные (запирающие) светофильтры: ЖС-3, ЖС-18, Т-1НиТ-2Н.

Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскола фильтров целевого назначения (возбуждающие, запира­ющие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещен­ных светофильтров обеспечивает цветную (зелено-желтую) флуорес­ценцию объектов на темном фоне поля зрения. Ход лучей в люми­несцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРТ попадают на светоделительную пластинку между объективом и оку­ляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светодели­тельную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинно­волновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпев­ших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону ис­точника света. Такое дифференцирующее свойство светоделитель-ной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоя­ми диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к па­дающим на нее лучам.

Существенное отличие микроскопов серии «Люам» т МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разны­ми параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесцен­ции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильт­рами и фильтрами возбуждающего света. При люминесцентной мик­роскопии в качестве иммерси­онной жидкости используют специальное нефлуоресцирую-щее масло (обычное иммерси­онное масло для этих целей не­пригодно из-за собственной люминесценции).

Преимущество люминесцентной микроскопии заклю­чается В ТОМ, ЧТО она дает цветное изображение, высокую сте-пень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах (цв. рис. I; рис.10). В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флюорохромированных объектов и метод флуоресциру-ющих-антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.

Люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить ряд важ­ных клеточных структур, изучить их изменения при разных функ­циональных состояниях организма, различать мертвые и живые клетки, облегчает количественный подсчет микроорганизмов.

Для люминесцентной микроскопии применяют осветитель ОИ-18 с ртутно-кварцевой лампой РК или СВДШ-120А в комби­нации с обычными биологическими микроскопами, или специ­альный люминесцентный микроскоп МЛ-2.

Рис.10 Вид препарата в люминесцентном микроскопе.

Рис. 11. Схема электронного микроскопа:

/ — к вакууму; 2— вакуумная трубка; J—к ис­точнику питания нити накала; 4— нить (катод); 5—анод; 6 — заземление; 7— электронный луч; 8— конденсорная линза; 9— объект; 10— объек­тивная линза; 11 — увеличенное изображение объекта; 12 — проекционная линза; 13 — люми­несцентный экран; 14 — фотографическая плас­тинка; /5— к источнику питания линз. То­чечной линией изображен ход электрон­ных лучей

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1360 | Нарушение авторских прав