Люминесцентная микроскопия.
Люминесценцией (lumen — свет, escent — слабое действие) называется свечение объекта, возбуждаемое поглощенной им световой энергией. Возбуждать люминесценцию можно как ультрафиолетовым излучением, так и коротковолновым излучением видимой части спектра — сине-фиолетовым. При этом может возникать люминесценция в цветовой гамме видимого спектра, что дает цветное светящееся изображение. Если объект сам не дает явления люминесценции, его подкрашивают специальными красителями — флуорохромами (акридин оранжевый, корифосфин, тиофлавин и др.).
Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа (рис. 9). Непосредственно между источником света и зеркалом микроскопа устанавливают сине-фиолетовый светофильтр, а на окуляр микроскопа — желтый светофильтр. Сине-фиолетовый свет, попав на препарат, возбуждает в последнем люминесценцию. Для того чтобы ее увидеть, необходимо убрать все сине-фиолетовые лучи, что и осуществляет желтый фильтр на окуляре, отсекающий коротковолновую часть спектра и пропускающий в глаз наблюдателя длинноволновый свет флуоресценции.
Ветеринарно-бактериологические лаборатории снабжены люминесцентными микроскопами серий МЛ и «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3 — модели рабочего типа; И-1, И-2, И-3 — модели исследовательского типа).
Атомы некоторых веществ, называемых люминофорами (люми-ногены, флуорохромы), поглощая энергию, переходят на более высокий энергетический уровень (возбуждаются). Возбужденное состояние слабоустойчивое, атомы возвращаются на стабильный низкоэнергетический уровень, отдавая избыток энергии в виде свечения — люминесценции. В зависимости от источника энергии возбуждения различают фото-, электро-, радио-, хемо- и рентге-нолюми несценцию.
В лабораторной практике в основном используют фотолюминесценцию — свечение, возбуждаемое энергией световых лучей. По длительности свечения различают люминесценцию кратковременную — флуоресценцию, быстро затухающую после прекращения воздействия возбуждающих лучей, и длительную — фосфоресценцию, продолжающуюся и после окончания возбуждения вещества. По правилу Стокса свет флуоресценции отличается от света возбуждения большей длиной волны, поэтому при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами получают длинноволновые свечения объектов, хорошо видимые простым глазом.
Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция присуща практически всем веществам, однако интенсивность свечения большинства из них невелика. Флуорох-ромы, связываясь с определенными химическими структурами клетки, придают им способность ярко люминесцировать при освещении объекта (препарата) сине-фиолетовыми лучами — вторичная люминесценция.
В люминесцентных микроскопах источником возбуждения служит ртутно-кварцевая лампа ДРТ-250. Для успешной люминесцентной микроскопии необходимо: 1) из светового потока, идущего от ртутно-кварцевой лампы, с помощью специальных светофильтров выделить коротковолновую (сине-фиолетовую) часть спектра для возбуждения свечения изучаемого объекта и отсечь лучи той же длины, что и лучи люминесценции (в противном случае все поле зрения будет интенсивно светиться). Для этого между источником света и исследуемым объектом ставят светофильтры (возбуждающие) УФС-3, ФС-1, СС-4 и др.; 2) из свето-воТо потока, идущего от изучаемого объекта в окуляр, пропустить длинноволновое свечение (люминесценцию) и одновременно защитить глаз наблюдателя от коротковолновых (возбуждающих) лучей. С этой целью между объектом и глазом наблюдателя помешают окулярные (запирающие) светофильтры: ЖС-3, ЖС-18, Т-1НиТ-2Н.
Сочетанное применение в оптической системе люминесцентного микроскола фильтров целевого назначения (возбуждающие, запирающие) называют принципом скрещенных фильтров. Эффект скрещенных светофильтров обеспечивает цветную (зелено-желтую) флуоресценцию объектов на темном фоне поля зрения. Ход лучей в люминесцентном микроскопе показан на рисунке 9. Лучи от лампы ДРТ попадают на светоделительную пластинку между объективом и окуляром. Ненужные длинноволновые лучи проходят через светоделительную пластинку и гаснут в кожухе микроскопа. Возбуждающие коротковолновые лучи пластинка отражает на изучаемый объект. Часть возбуждающих лучей трансформируется на объекте в длинноволновые лучи люминесценции, которые проходят через объектив, светоделительную пластинку, запирающие фильтры и попадают в глаз наблюдателя. Другую часть возбуждающих лучей, не претерпевших изменений, светоделительная пластинка отражает в сторону источника света. Такое дифференцирующее свойство светоделитель-ной пластинки обусловлено тем, что она покрыта несколькими слоями диэлектриков и расположена под углом 45° по отношению к падающим на нее лучам.
Существенное отличие микроскопов серии «Люам» т МЛ — наличие у «Люмам» сменных светоделительных пластин с разными параметрами возбуждающего спектра и спектра люминесценции, комбинируемых с соответствующими запирающими фильтрами и фильтрами возбуждающего света. При люминесцентной микроскопии в качестве иммерсионной жидкости используют специальное нефлуоресцирую-щее масло (обычное иммерсионное масло для этих целей непригодно из-за собственной люминесценции).
Преимущество люминесцентной микроскопии заключается В ТОМ, ЧТО она дает цветное изображение, высокую сте-пень контрастности, возможность обнаруживать в исследуемом материале бактерии в небольших количествах (цв. рис. I; рис.10). В микробиологии нашли применение такие виды исследований, как люминесцентная микроскопия флюорохромированных объектов и метод флуоресциру-ющих-антител (МФА) в экспресс-диагностике инфекционных болезней.
Люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить ряд важных клеточных структур, изучить их изменения при разных функциональных состояниях организма, различать мертвые и живые клетки, облегчает количественный подсчет микроорганизмов.
Для люминесцентной микроскопии применяют осветитель ОИ-18 с ртутно-кварцевой лампой РК или СВДШ-120А в комбинации с обычными биологическими микроскопами, или специальный люминесцентный микроскоп МЛ-2.
Рис.10 Вид препарата в люминесцентном микроскопе.
Рис. 11. Схема электронного микроскопа:
/ — к вакууму; 2— вакуумная трубка; J—к источнику питания нити накала; 4— нить (катод); 5—анод; 6 — заземление; 7— электронный луч; 8— конденсорная линза; 9— объект; 10— объективная линза; 11 — увеличенное изображение объекта; 12 — проекционная линза; 13 — люминесцентный экран; 14 — фотографическая пластинка; /5— к источнику питания линз. Точечной линией изображен ход электронных лучей
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1383 | Нарушение авторских прав
|