АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Тема 5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микроорганизмы, выращенные в лабораторных условиях, на­зывают микробными культурами. Для получения культуры исследу­емый материал (кровь, эмульсия тканей, отечная жидкость, гной, молоко и др.) высевают на стерильные питательные среды в про­бирках, колбах или чашках Петри и помещают на определенное время в специальные шкафы-термостаты, где постоянно поддер­живается необходимая для разных групп микробов температура (37...38°С;26...30^оС;22...25°С).

Оборудование для культивирования. Лабораторный термостат (рис.31) представляет собой двустенный шкаф, снаружи покрытый теплоизоляционным материалом (пластиком). Термостаты могут быть водяные и суховоздушные. В водяном тер­мостате между двойными стенками заливают воду (обычно дис­тиллированную), в суховоздушном от нагретой внутренней метал­лической обшивки нагревается циркулирующий внутри воздух. Нагретые вода или воздух через внутреннюю металлическую стен­ку передают теплоту внутрь шкафа. Подключают термостат к электросети, так как в нижней части его между стенками вмонти­рованы электрообогреватели. Внутри термостата имеется несколь­ко сетчатых полочек, на которые помещают штативы или специ­альные, корзиночки с пробирками, колбы, чашки Петри, эксика­торы, микроанаэростаты с посевами.

Температура в термостате поддерживается при помощи термо­регулятора. При повышении температуры выше нужного уровня терморегулятор автоматически выключает обогреватель, а при по­нижении — включает его. Терморегуляторы могут быть биметал­лические, «подушечные» и контактные (ртутные).

Биметаллический терморегулятор состоит из двух спаянных между собой цинковой и латунной пластинок, изогнутых U-об-разно. Одна ветвь этой пластинки прикрепляется неподвижно к внутренней стенке термостата, вторая — свободная, подвижная, с электроконтактом находится на очень близком расстоянии от клеммы, соединенной с электросетью. При нагревании термостата в силу различного коэффициента расширения цинковой и латун­ной пластинок подвижная ветвь, отклоняясь в сторону, выключа­ет обогревание термостата. Температуру в термостате предварительно регулируют установлением клеммы на определенное расстояние от свободной пластинки тер­морегулятора.

Принцип действия у «ло- душечных» терморегуляторов основан на том, что плоская

Рнс. 31. Термостат:

контактный термометр; 2— дверцы термостата; 3— полки

латунная гофрированная коробочка с запаянной в ней жидкостью укрепляется таким образом со специальным устройством, что при нагревании выше заданной температуры жидкость в коробочке, расширяясь, оказывает давление на ее стенки и происходит от­ключение от сети. По мере охлаждения термостата жидкость в ко­робочке также охлаждается и не давит на ее стенки («подушеч­ки»), поэтому стержень с рычажком, к которому плотно подходит «подушечка», включаются в сеть обогревания.

В современных термостатах обычно применяют контактный терморегулятор — ртутный термометр с впаянными с двух сторон платиновыми проволоками. Один конец проволоки достигает ка­нала термометра, а другой заканчивается снаружи клеммой. Про­волоку с помощью наружного магнита располагают на различном уровне от столбика ртути в термометре, и температура автомати­чески поддерживается в термостате.

Для культивирования анаэробов и микроаэрофильных бакте­рий используют эксикатор и анаэростат.

Эксикатор представляет собой стеклянный сосуд с при­тертой крышкой. На его дно ставят часовое стекло или открытую чашку Петри с химическими веществами, которые активно связы­вают кислород воздуха [например, пирогаллол с гидроксидом (ед­ким натром)]. Сверху на специальный выступ эксикатора кладут фарфоровую подставку с отверстиями, а на нее пробирки или чашки с посевами и плотно закрывают крышку. Для герметичнос­ти края эксикатора смазывают вазелином; затем эксикатор поме­щают в термостат.

Анаэростат (рис. 32) — металлический герметически зак­рывающийся цилиндрический сосуд, снабженный кранами для удаления воздуха или подачи нужного для работы газа (СО₂, Ni, О₂ и др.) и вакуум-манометром. Посевы помещают внутрь цилин­дра, закрывают крышкой и с помощью насоса из анаэростата уда­ляют воздух. Степень разрежения внутри прибора показывает ва­куум-манометр в миллиметрах ртутного столба (от 0 до 760). Анаэростат с посе­вами также ставят в термостат.

Питательные среды. Техника посева микроорганизмов. Любая микробиологи­ческая работа и, следовательно, выпол­нение любой практической задачи свя­заны с приготовлением питательных сред для выращивания микроорганиз-

Рис. 32. Анаэростат:

/ — манометр; 2— кран для отвода воздуха; 3 — крышка; 4— емкость для размещения посевов

мов. Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а также для выращивания культур с целью ис­следования их обмена веществ или получения биологических пре­паратов и ценных продуктов метаболизма.

Среда должна содержать все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов клетки: источники углерода, азота, зольные элементы, микроэлементы. Синтетичес­кие возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, поэтому очень разнятся их потребности в источниках питания. Следовательно, универсальных сред, одина­ково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Разнообразие обмена веществ микроорганизмов обусловлено источниками углерода и азота; вот почему эти элементы представ­лены в средах различными веществами и именно они определяют специфичность сред.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в каче­стве единственного источника углерода диоксид углерода или кар­бонаты, тогда как потребность в углероде гетеротрофных микро­организмов данные соединения углерода не могут удовлетворить.

Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолога-биохимических особенностей организ­ма могут быть представлены различными органическими соеди­нениями, например кислотами, спиртами, углеводами, углеводо­родами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и к источнику азо­та. В состав всех сред входят различные азотсодержащие соедине­ния. Это могут быть нитраты или соли аммония, одна или не­сколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуж­дающиеся в полном наборе аминокислот или белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных элементах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет од­них и тех же минеральных солей. Поэтому так называемый «мине­ральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Кроме элементов, необходимьтх для конструктивных процес­сов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных организмов соединения уг­лерода в большинстве случаев служат и энергетическим материа­лом. В средах для хемоавтотрофных организмов эту роль выполня­ют минеральные соли.

Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорга­низмов. Кроме того, среды для одного и того же микроорганизма могут отличаться в зависимости от цели исследования. Например, среда для длительного сохранения микроорганизма в лабораторных условиях заметно отличается от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ.

Однако какой полноценной ни была бы среда, ее компоненты могут остаться недоступными, если активная кислотность среды (рН) не соответствует значениям, при которых возможно развитие изучаемых микроорганизмов. Поэтому в приготовленной среде проверяют значение рН и, если необходимо, доводят его до нуж­ной величины растворами кислот (HCi, H₂SO₄), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na₂CO3, >JaHCO₅). В процессе стерилизации рН сред может изменяться, поэтому нередко требуется дополнительное определение его в сте­рильных средах и в случае надобности корректирование стериль­ными растворами кислоты или щелочи.

i Среды для культивирования в зависимости от состава составля­ют две группы; 1) естественные (натуральные) среды неопределен­ного или искусственного состава, 2) синтетические среды. Нату­ральные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагности­ческих целей. Примерами натуральных сред неопределенного со­става, которые широко применяют в лабораторной практике, слу­жат мясопептонный бульон, агар, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды.

(Необходимость культивирования микробов обусловлена не только выделением возбудителя болезни из исследуемого матери­ала и определением его вида, но и накоплением микробной массы для изготовления биологических препаратов: вакцин, антигенов и аллергенов. Для культивирования микроорганизмов в лаборатор­ных условиях применяют различные искусственные питательные

среды.

Питательные среды бывают: по консистенции — жидкие, плот­ные, полужидкие; по происхождению —животного, растительно­го происхождения и синтетические среды постоянного состава; по назначению —обычные, или простые, для выращивания боль­шинства микроорганизмов; специальные — для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питатель­ных средах; дифференциально-диагностические — употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, про-теолитических, редуцирующих и других свойств); селективные — для выделения микробов одного рода или вида из материала, со­держащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; среды обогащения

(накопительные).

Основу многих питательных сред животного происхождения составляет мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжь­его мяса, не содержащего костей, фасций, сухожилий. Измель­ченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1: 2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстра­гируют 12...24 ч, кипятят 1,5...2 ч, фильтруют, добавляют дистил­лированную воду до первоначального объема, разливают в буты­ли, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Обычные (простые) среды. Мясопептонный бульон (МПБ) — жидкая питательная среда. Для его приготовления к I л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой по­варенной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, по­этому МПБ подщелачивают — добавляют небольшое количество 10—15%-го раствора КОН или NaOH, кипятят 2...3 мин, проверя­ют рН электропотенциометром. Мясопептонный бульон фильтру­ют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклави-руют.

Мясопептонный агар (МПА) — плотная питатель­ная среда. К МПБ добавляют 2 % агар-агара (безазотистое органи­ческое вещество, полученное из морских водорослей) и кипятят до его расплавления, в горячем виде определяют рН, кипятят еще 5... 10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром укладывают на­клонно под углом 5...6 "С: при застывании образуется скошенная плотная поверхность. Для посева на агаровые пластинки его зали­вают в чашки Петри (рис. 33).

Мясопептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА; различие заключается в том, что агар-агара добавляют меньше — 0,15...0,25 %.

Специальные питательные среды. Бульон Мартена. Свиные желудки (или сычуги рогатого скота) очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке, заливают водой (1: 4) и добав­ляют 1 % (к объему жидкости) соляной кислоты. Смесь выдержи­вают при 50 "С 24 ч, нейтрализуют 20%-м раствором NaOH до ще­лочной реакции по лакмусу, автоклавируют при 120 X 15 мин. Для приготовления бульона смешивают равные объемы мясной воды и полученной смеси, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-м раствором NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют, разлива­ют в пробирки, автоклавируют при 50,6 кПа (110 °С) 30 мин.

Агар Мартена. Добав­ление 2 % агара обеспечивает по­лучение плотной среды.

Бульон Хоттингера. Готовят из триптического гидро-лизата (перевара) мясных отхо­дов—фасций, жира, сухожилий:

1кг мясных обрезков заливают

2л кипящей воды, кипятят 5 мин,

охлаждают ДО 45 °С И добавляют Рис. 33. Разлив агара в чашки Петри

5...10 г панкреатина, подщелачивают до рН 7,8...8,0 бикарбонатом натрия, встряхивают и доливают хлороформ (10 мл на 1 л), плот­но закрывают, выдерживают в теплом месте Юсут, ежедневно встряхивая. Полученный перевар подкисляют соляной кислотой до рН 5,5. Хранят в темном месте. Для приготовления питатель­ной среды к 1 л воды добавляют 100...200 мл полученного перева­ра, кипятят 1...2 мин, фильтруют, подщелачивают, стерилизуют. Агар Хоттингера готовят так же, как и обычный МПА.

Сахарный (глюкозный) бульон (или агар). Из­готавливают, как обычные среды, но добавляют 1...2 % глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 50,6 кПа.

Мясопептонная желатина (МПЖ). К М ПБ добав­ляют 10...20 % желатины (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют, устанавливают нужную реакцию горячей среды, пропускают через ватно-марлевый фильтр, разли­вают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно.

Мясопептонный печеночный бульон К и т т а-Т а р о ц ц и. Жидкая среда для культивирования анаэ­робов. Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусоч­ками, заливают водой (1: 1), кипятят, фильтруют. Затем печеноч­ную воду добавляют в МП Б (2: I) (на 2 л МПБ I л печеночного от­вара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высо­ким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1...2 мл вазе­линового масла и стерилизуют в автоклаве при 4,9 Па 30 мин.

Сывороточный бульон и сывороточный мясопеп­тонный агар. В МПБ или расплавленный и охлажденный до 45...50Х МПА асептически добавляют 5...10% стерильной сыво­ротки крови лошади (или барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки. Сывороточный МПА разливают в пробирки (столбиком) или в чашки Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Кровяной МПА. Применяют для выявления гемолитических свойств бак­терий. Предварительно в стерильную колбочку со стеклянными бусами асептично берут кровь (у барана, лошади или кролика) и встряхивают 15...20 мин, чтобы фибрин отделить от остальной массы крови (фибрин сгустками осаждается на бусах). Дефибри-нированную кровь (5...10 %) стерильно добавляют к расплавлен­ному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равно­мерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Среды Гисса. В пептонную воду (дистиллированная вода, 0,5 % натрия хлорида и 1 % пептона) добавляют 0,5%-й ра­створ углевода (сахар или многоатомный спирт) и 0,5%-й раствор индикатора Андрэдэ. Обычно готовят набор сред из разных угле­водов, каждую в отдельности. Используемый индикатор представ­ляет собой 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4%-го раствора NaOH, 100 мл дистиллированной воды. Среды с углеводами разливают в пробирки с поплавками, опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно.

Среды Гисса могут быть жидкими и полужидкими (без газов), содержащими 0,25 % агара. При ферментации того или иного уг­левода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикато­ра. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся при фер­ментации углевода газообразные продукты скапливаются в по­плавках.

Среда Эндо. В расплавленный МПА (рН 7,4...7,6) вносят 0,5...1%-й раствор лактозы и 0,5 % насыщенного спиртового ра­створа основного фуксина, обесцвеченного добавлением по кап­лям 10 % сернокислого натрия. Среду кипятят и разливают в чаш­ки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу, растут в виде крас­ных колоний.

Среда Левина. Приготовленный 2%-й агар на бульоне Хоттингера (рН 7,2...7,4) стерилизуют в автоклаве. К 100 мл гото­вого расплавленного агара добавляют 2 мл 0,5%-го раствора мети-леновой сини, 1,5 мл 2%-го эозина (щелочного бактериологичес­кого), 2 г лактозы и 0,2 г двухосновного фосфорнокислого калия (К2НРО4). Растворы красителей готовят на дистиллированной воде и стерилизуют в аппарате Коха. Раствор метиленовой сини перед употреблением подогревают на водяной бане и добавляют в агар в теплом виде. После добавления этих компонентов среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда фи­олетового цвета.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона—Блера). Представляет собой МПА (рН 7,5) с индикатором, содержащим цитрат висмута, сульфат натрия, соль Мора (серно-аммонийная соль железа), двухосновной фосфат натрия, глюкозу и бриллиан­товую зелень. В настоящее время висмут-сульфит агар (как и агар Эндо, среду Плоскирева) промышленность выпускает в сухом по­рошкообразном виде: 6 г сухого порошка растворяют в 100 мл дис­тиллированной воды, подогревают при непрерывном помешива­нии, разливают в стерильные пробирки и оставляют в наклонном положении.

Применяют также среды с химическими веществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (редуцирующих) процессов, обусловленных ферментами бакте­рий. Для этого готовят молоко с метиленовой си­нью. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают би­карбонатом (NaHCO₃) натрия до слабощелочной реакции по лак­мусовой бумаге, добавляют 1%-й водный раствор метиленовой сини до голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно.

Среды накопления (обогащения) используют, если предполагает­ся, что в исследуемом материале присутствует небольшое число бактерий. Среда Шустовой: к МПА (рН 7,4) добавляют 10 % 50%-го водного раствора гипосульфита и 2 % раствора Л юго-ля. Применяют для накопления сальмонелл. Среда Раппо­порта: к МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи и 3 % инди­катора Андрэде. Стерилизуют текучим паром.

Синтетические среды. Применяют для изучения процессов ме­таболизма и других биологических особенностей бактерий. В их состав входят химически чистые растворимые в воде вещества в строго определенных количествах: фосфат (фосфорнокислый) ам­моний, фосфат калия, хлорид натрия, сульфат магния, глюкоза или другие углеводы, никотинамид и др. По мере необходимости готовят плотные синтетические среды путем добавления агара. Стерилизуют в автоклаве.

Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют следующие среды.

Синтетическая среда Ван-Итерсона: нитри­та аммония (NaH₄NO₃) 0,5 г, нитрата калия одноосновного {КН3РО4) 0,5 г, воды водопроводной 1 л; автоклавируют при 101,6 кПа 20 мин.

Глюкозный агар Сабур о: глюкозы 4,0 г, пептона 1,0 г, агара 1,8 г, воды 100 мл. Стерилизуют автоклавированием.

Агар Литмана с бычьей ж е л ч ь ю: пептона 10,0, глюкозы 10,0, обезвоженной бычьей желчи 15 мл, кристаллвиоле-та 0,01, воды I л, агара 20,0. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 мин. Разливают в чашки толстым слоем, чтобы предупредить обезвоживание среды.

Осветление сред. Осветленные агаризованные или желатиновые среды необходимы в диагностических исследованиях и для полу­чения хорошо видимых изолированных колоний анаэробных мик­роорганизмов. В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфильтровав ее от осадка через вату.

Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриных яиц. Для осветления 500 мл среды достаточно белка одного яйца. Белок тщательно отделяют от желтка и встря­хивают с равным объемом воды до образования густой пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и за­тем остуженную до 45...50 °С среду. Перед внесением белка прове­ряют значение рН среды и, если необходимо, среду подщелачива­ют до рН 7,0...7,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане в течение 1 ч. Белок сверты­вается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Среду быс­тро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом лучше всего пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, которые предотвращают застывание среды во время фильтрования.

Синтетические агаризованные среды, внесение белка в кото­рые нежелательно, осветляют следующим образом. Среду, налитую в химический стакан, автоклавируют и оставляют после сте­рилизации в закрытом автоклаве на 10...12 ч. При таком медлен­ном остывании среды все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана. Верхнюю прозрачную часть среды срезают, помещают в колбу и вновь сте­рилизуют.

Определение активной кислотности среды. Активную кислот­ность среды (рН) обычно определяют электрометрически, кроме того, можно выборочно в 2...3 пробирках —колориметрически. Для электрометрического определения рН растворов широко ис­пользуют лабораторный потенциометр ЛПУ-01, в котором для из­мерения величины рН предназначена электродная система со стеклянным электродом. Стеклянный электрод представляет со­бой трубку с напаянным на конус полым шариком из литиевого электродного стекла. При погружении электрода в раствор между поверхностью шарика электрода и раствором происходит обмен ионами, в результате которого ионы лития в поверхностных слоях стекла замещаются ионами водорода и стеклянный электрод при­обретает свойства водородного электрода. Между поверхностью стекла и исследуемым раствором возникает разность потенциалов, величина которой определяется активностью ионов водорода в ра­створе.

Для создания электрической цепи используют внутренний электрод, осуществляющий электрический контакт с раствором, заполняющим внутреннюю часть стеклянного электрода, и вне­шний (вспомогательный) электрод, осуществляющий электричес­кий контакт с исследуемым раствором. Для защиты от воздей­ствия высоких температур вспомогательный электрод помещают вне исследуемого раствора и соединяют с ним при помощи элект­ролитического ключа —трубки, заполненной насыщенным ра­створом хлорида калия и заканчивающейся пористой перегород­кой. Раствор КС1 непрерывно просачивается через пористую пе­регородку, предотвращая проникновение из исследуемого раство­ра в систему электрода посторонних ионов, которые могут изменить электродвижущую силу (ЭДС) электрода. Суммарная ЭДС электродной системы линейно зависит от величины рН ра­створа. Определяют рН исследуемого раствора, измеряя ЭДС электродной системы с помощью электронного милливольтметра, шкала которого градуирована в единицах рН. Потенциометр ЛПУ-01 имеет устройство для ручной и автоматической коррек­ции показаний прибора при изменении температуры. При изме­рении рН растворов, температура которых отличается от комнат­ной, следует применять автоматическую температурную компен­сацию либо при каждом измерении устанавливать указатель руч­ного корректора на температуру исследуемого раствора. При работе с автоматическим термокомпенсатором последний должен быть погружен в исследуемый раствор не менее чем на 40 мм. Элементы измерительной схемы прибора и его электронный усили­тель размешены в металлическом корпусе, а элементы управления прибором выведены на переднюю панель.

Техника посева микробов. Для получения бактериальных куль­тур из молока, масла, сена, силоса, воды, гноя и тканей погибших животных делают посев на стерильные питательные среды. Мани­пуляцию проводят обязательно вблизи горящей газовой или спир­товой горелки, чтобы во время посева избежать бактериального загрязнения извне. Посев производят петлей или пастеровской пипеткой. Поступающий в лабораторию для исследования мате­риал регистрируют в специальном журнале.

Перед посевом необходимо тщательно сделать надпись на про­бирке (колбе или чашке Петри) с указанием номера экспертизы, названия микроорганизма и даты посева. Надпись делают черни­лами по стеклу или наклеивают этикетку. Бактериологический материал для посева или приготовления препаратов берут бакте­риологической петлей или иглой, если микроорганизмы выраще­ны на плотной среде; для взятия клеток из жидкой среды чаще используют стерильные пипетки.

Бактериологические петли иглы сделаны из тонкой платино­вой или нихромовой проволоки, которую закрепляют в металли­ческом держателе или впаивают в стеклянную палочку. Диаметр бактериологической петли составляет 2...4 мм. Бактериологичес­кую петлю (иглу) перед взятием клеток микроорганизмов стери­лизуют. Для этого проволоку прокаливают докрасна в пламени го­релки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, которая будет вводиться внутрь сосуда, содержащего микроорганизмы. При прокаливании петлю держат в пламени по­чти вертикально, чтобы вся проволока была равномерно раскале­на. Сразу же после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами.

Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю (иглу) вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, где отсутствует рост, и только после это­го захватывают небольшое количество микробной массы.

Отбор клеток микроорганизмов, выращенных на плотной сре­де в пробирке, осуществляют следующим образом. Пробирку с культурой берут в левую руку таким образом, чтобы поверхность питательной среды с налетом выросших микроорганизмов была обращена кверху и хорошо видна. Пробирку держат в горизон­тальном или несколько наклонном положении. В правую руку бе­рут петлю и держат ее как карандаш, прокаливают в пламени го­релки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным паль­цем правой руки прижимают наружный конец ватной пробки к ладони и вынимают пробку из пробирки. Края открытой пробир­ки слегка обжигают в пламени горелки, вводят в пробирку сте­рильную петлю и, отобрав небольшое количество микробной массы, вынимают петлю из пробирки. Горлышко пробирки снова об­жигают в пламени горелки, затем обжигают внутренний конец ватной пробки и закрывают ею пробирку, которую ставят в шта­тив, а извлеченный материал используют для приготовления пре­парата.

Клетки микроорганизмов, оставшиеся на петле после приго­товления препарата, сжигают в пламени горелки. В этом случае прокаливание петли начинают с участка проволоки, примыкаю­щего к кольцу, чтобы клетки, оставшиеся на петле, подсохли и не образовали аэрозоль, загрязняющий воздух. Затем петлю перево­дят в вертикальное положение, прокаливают докрасна и только после этого ставят на место.

Клетки микроорганизмов, выросшие в жидкой среде, отбирают стерильной пипеткой, реже — петлей. Для этого пипетку вынимают за верхний конец из бумаги, в которой она стерилизовалась, и берут средним и большим пальцами правой руки. В левую руку берут пробирку (колбу) с жидкой средой, открывают пробку, соблюдая все предосторожности, описанные выше, пипетку вводят в сосуд.

Отобрав часть среды, закрывают сосуд пробкой. Взятую пробу используют для приготовления препарата или посева в свежую питательную среду. После этого пипетку немедленно помещают в дезинфицирующий раствор (0,5...3%-й водный раствор хлорамина или 3...5%-й водный раствор фенола), не касаясь ею окружающих предметов.

При пересеве клеток микроорганизмов с одной среды на дру­гую в левую руку удобно взять две пробирки — одну со стерильной средой (дальше от себя), другую —с культурой микроорганизмов (ближе к себе), а в правую руку — бактериологическую петлю. Стерилизуют петлю в пламени горелки, затем, прижав пробки двух пробирок к ладони мизинцем и безымянным пальцами пра­вой руки, открывают пробирки. Бактериологической петлей отби­рают клетки микроорганизмов и вводят петлю в пробирку со сте­рильной скошенной средой почти до дна; петлю выводят вверх зигзагообразно или прямо (штрих). Посев иглой осуществляют в такой же последовательности, как и посев петлей, с той лишь раз­ницей, что в толщу плотной среды делают укол.

Если посев делают в жидкую среду, то пробирки держат почти вертикально, чтобы не замочить пробки. Петлю с клетками мик­роорганизмов погружают непосредственно в среду.

Все описанные выше манипуляции проводят около пламени горелки (но не в пламени!) по возможности быстро, чтобы не заг­рязнить культуру посторонними микроорганизмами. Не следует делать резких движений, ходить около проводящего посев микро­организмов, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения культуры.

При посеве в жидкие среды (молоко, МПБ) в ле­вой руке держат пробирку в таком же положении, как и при изготовлении препарата-мазка; в правой руке находится петля (или пипетка) с засеваемым материалом и пробка пробирки. Около пламени горелки петлю с каплей материала (или пипетку) вносят в пробирку со средой, слегка погружая в нее. Закрыв пробирку пробкой, петлю прожигают на огне, а пастеровскую пипетку опус­кают в банку с дезраствором (карболовой кислотой, лизолом, фор­малином и др.). Во время работы следят, чтобы среда не касалась пробки и не вылилась. Засеянные питательные среды помещают в

термостат.

При посеве на плотную среду пробирки с засе­ваемой (пересеваемой) культурой и со стерильной питательной средой (МПА) берут в наклонном положении (скошенная поверх­ность агара сверху) в левую руку, пробками в сторону пламени го­релки. В открытую у пламени пробирку с культурой (или другим материалом) осторожно вводят петлю, слегка прикасаясь ею по­верхности исследуемого материала, и, взяв небольшое количество (одну каплю), переносят его в другую пробирку со стерильной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденса­ционную жидкость и зигзагообразными движениями петлей про­водят вверх по скошенной поверхности агаровой среды. При по­севе уколом в плотную среду пробирку удерживают в горизонталь­ном положении. Посевы (пробирки) ставят в термостат для куль­тивирования. Через 16...18, 24...48 ч учитывают результат и изучают культуральные свойства бактерий.

В жидкой среде рост микроорганизмов проявляется либо в виде равномерного помутнения за счет увеличения числа бакте­риальных клеток, либо осадка (в этом случае среда остается про­зрачной). Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании пробирки, или слизистый, поднимающийся в виде «косички», «смерчика*», а также в виде сплошной массы на дне пробирки или мелких крупинок, располагающихся на стекле пробирки. Некоторые виды микроорганизмов из-за повышенной потребности в кислороде воздуха растут на поверхности жидкой среды, образуя пленку и не вызывая помутнения бульона. Плен­ка может быть сухой и слизистой, гладкой и складчатой. В ряде случаев бактериальные культуры дают одновременно помутне­ние среды, обильный осадок и пристеночное кольцо на поверх­ности.

На плотной среде культуральные свойства определяют по ха­рактеру развивающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого числа бактериальных клеток наблюдают сплош­ной рост микробной массы. При высеве небольшого числа клеток на среду с большой поверхностью из каждой бактериальной клет­ки в результате ее деления (размножения) формируется колония. В зависимости от диаметра колонии могут быть крупные (более 2 мм), мелкие (1...2 мм), или совсем маленькие в виде мельчайших росинок. Различают колонии сухие, влажные (сочные) или слизистые; гладкие, глянцевые, шероховатые с неровной поверхностью, с ровными или не ровными краями, выпуклые, плоские и с углуб­лением по середине, прозрачные и матовые, бесцветные или пиг­ментированные. Колонии многих видов бактерий, актиномице-тов, плесневых грибов, дрожжей при росте на различных пита­тельных субстратах могут принимать различную окраску, обуслов­ленную выделением красящих веществ —пигментов. (Если пигменты растворимые, окрашивается вся среда, а если не раство­римые, тогда окрашивается микробная масса колоний.) Для раз­личных видов микроорганизмов характерно образование пигмента определенного цвета — сине-зеленого, золотистого, белого, кре­мового, лимонно-желтого, пурпурно-красного и др. Пигментооб-разование ярче выражено на плотных средах (картофель, молоч­ный агар и др.). Для данного процесса имеет значение темпера­турный уровень; оптимум для многих видов составляет 25...3СГС. Определенное влияние оказывают кислород воздуха и рассеянный свет.

Особенности роста микроорганизмов на плотных и в жидких сре­дах (культуральные признаки). Рост на плотной среде. Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, об­разуют характерные для данного вида колонии. Поэтому вид ко­лоний — один из признаков, который необходим для идентифи­кации исследуемого микроорганизма. При описании учитывают следующие признаки колоний: форму — округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и др.; размеры, диаметр (мм); если раз­меры колонии не превышают I мм, то такие колонии называют точечными; оптические свойства — прозрачная, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая, матовая, флуоресци­рующая; цвет — самой колонии и среды; поверхность — гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая; профиль — плоский, выпук­лый, кратерообразный, врастающий в агар и др.; край — ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и др,; структуру — однород­ная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; консистенцию — маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая; способность к эмульгированию — равномерная или зернистая суспензия в воде, слабо или совсем не суспендируется в воде. Край и структуру ко­лонии определяют при малом увеличении микроскопа; чашку Петри в этом случае помещают на столик микроскопа крышкой вниз (рис. 34...36).

Консистенцию колонии устанавливают прикосновением к ее поверхности микробиологической петлей. При посеве клеток в толщу плотной питательной среды наряду с поверхностными ко­лониями образуются глубинные и донные колонии. Глубинные колонии довольно однообразны и чаще всего имеют вид сплю­щенных чечевичек, лишь у немногих видов бактерий они напоми­нают клочки ваты из-за нитевидных выростов в толщу среды. Если микроорганизмы в процессе развития выделяют газы, обра

Рис. 34. Формы колоний (вид сверху)

зование глубинных колоний сопровождается разрывом плотной среды. Еще менее характерны донные колонии, образующиеся при соприкосновении агаризованной среды с дном чашки Петри. Эти колонии обычно имеют вид довольно крупных бесцветных прозрачных налетов.

Описание колонии часто дополняют характером роста микро­организмов по штриху на поверхности скошенной плотной пита­тельной среды. При этом отмечают его интенсивность — скудный, умеренный, обильный и особенности — налет сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный в виде цепочки изолирован­ных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоид

Рис. 35. Формы колоний (вид сбоку)

ный. Отмечают оптические свойства штриха, его цвет, поверх­ность и консистенцию. При описании колонии и роста микроор­ганизмов по штриху обязательно указывают состав среды и воз­раст культуры, так как колонии одного и того же микроорганизма на различных средах могут отличаться рядом признаков. В опреде­лителях обычно приведены описания колоний и роста микроорга­низмов по штриху только на мясопептонном агаре или на мясо-пептонном агаре и мясопептонной желатине.

Рост на картофеле. Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Особенность роста на картофеле является диагностическим признаком и играет определенную роль при идентификаций. Ломтики картофеля подготавливают в качестве среды следующим образом. Клубни тщательно моют во­дой, очищают от кожуры и пробочным сверлом вырезают кусоч­ки в форме цилиндра длиной 4...5 см. Цилиндры разрезают по диагонали (на клинья) и для нейтрализации клеточного сока по­гружают на 1 ч в 1%-й раствор гидрокарбоната натрия (NaHCO₃) или скошенную поверхность картофеля натирают мелом. После этого кусочки картофеля помеща

ют в пробирки, на дно которых предварительно положена вата, смоченная водой. Стерилизуют картофель при 50кПа.

Посев делают петлей, втирая посевной материал в скошенную поверхность картофеля. Отмечают рост микроорганизмов или его отсутствие. Если рост есть, то указывают его интенсивность и ха­рактерные особенности, используя те же признаки, что и при опи­сании роста па плотных средах. Особое внимание обращают на образование пигмента.

Рост в жидкой среде. Рост микроорганизмов в жид­ких питательных средах при стационарных условиях культивиро­вания характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных средах. Он сопровождается помутнением сре­ды, образованием пленки или осадка. Отмечая особенности роста в жидких средах, указывают прежде всего его интенсивность: скудный, умеренный или обильный. Помутнение среды может быть однородным, хлопьевидным или с шелковистой волнистос­тью.

Если образуется пленка, указывают ее особенности: кольцеоб­разная или сплошная, тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, сухая или слизистая, всползающая или опадающая.

При образовании осадка характеризуют его свойства: скудный или обильный, рыхлый, плотный, хлопьевидный, зернистый или слизистый. Обычно для того чтобы охарактеризовать рост в жид­кой среде, используют МПБ. Если изучаемый микроорганизм не растет в МПБ, то подбирают такую жидкую среду, которая под­ходит для него. Рост в МПБ и в жидких средах описывают, ис­пользуя 4...7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1538 | Нарушение авторских прав