АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Тема 6. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРОБОВ

Чистой культурой называют микроорганизмы одного вида, вы­росшие на питательной среде отдельно от других видов. Часто употребляемый термин разновидность применим к микроорганиз­мам определенного вида, но отличающегося от последнего каким-либо одним признаком. Штаммом называют культуру одного вида микробов, выделенную из конкретного источника (из органов жи­вотного, из корма, пробы почвы, воды и других объектов). Клон — культуры микробов, происходящие из одной клетки.

Выделение чистой культуры. Метод Дригальского. Берут несколько чашек Петри со стерильным МПА, в одну из них на поверхность агара наносят каплю смеси бактерий. Специаль­ным шпателем или пастеровской пипеткой, изогнутой на огне го­релки в виде шпателя, растирают каплю по поверхности агара, закрывают крышкой чашку. Этим же шпателем растирают поверх­ность другой чашки, затем третьей, четвертой и т.д. Чашки помещают в термостат, перевернув вверх дном, чтобы образующийся конденсат не смывал культуру. Самый густой рост будет в первой чашке, в последней чашке обычно получают изолированные друг от друга колонии. Колонии изучают по их внешнему виду, из них готовят бактериологический препарат, окрашивают и микроско-пируют. Отобрав колонию с характерными признаками и соот­ветствующими морфологическими, тинкториальными свойства­ми для искомого вида возбудителя, из нее бактериологической петлей производят посев в пробирки с МПБ и МПА (отвивка, пересев колонии) для получения чистой культуры одного вида микробов.

Для выделения чистой культуры бактерий часто используют метод, основанный на неодинаковом воздействии химических ве­ществ, антибиотиков, добавленных к питательным средам, на раз­витие разных видов микробов. Эти вещества, угнетая рост одних видов, не влияют на рост других. На этом принципе основано применение многих элективных сред с красками: яично-крах-мальные среды для выделения микобактерий туберкулеза, глюко-зо-печеночная среда с генцианвиолетом (или кристаллвиолетом) для получения роста бруцелл и подавления роста других видов микроорганизмов.

Метод Пастера. Основан на последовательном разведе_: нии в 10 пробирках с жидкой средой капли смеси бактерий с рас­четом получить в последней пробирке чистую культуру. Кох, вве­дя в лабораторную практику использование плотных сред, приме­нил принцип Пастера, но разведения производил в плотной рас­плавленной среде и содержимое каждой пробирки с разным количеством исследуемого материала выливал в отдельную чашку Петри. После выдерживания в термостате в последних чашках с наибольшим разведением обнаруживают изолированные колонии. Пересеяв отдельную колонию в среды в пробирках, культивируя в термостате, получают чистую культуру. При исследовании воды, молока, фекалий и других материалов используют методы, пред­ложенные Пастером и Кохом.

При выделении спорообразующих микроорганизмов, учитывая стойкость спор при нагревании, исследуемый материал (или смесь выросших разных культур) прогревают в водяной бане при 80 °С в течение 30 мин, при этом все вегетативные формы погибают, а споры сохраняются. После прогревания производят пластинчатый посев по Дригальскому с последующей отвивкой колонии. Поми­мо этого метода при выделении культуры спорообразующего па­тогенного вида микроба прибегают к биопробе: после прогрева­ния смесь микробов вводят подкожно лабораторному животному (белая мышь, морская свинка); через 1...3сут животное гибнет. Труп вскрывают и из разных внутренних органов пастеровской пипеткой производят посев на питательные среды для получения чистой культуры возбудителя.

Нередко для выделения чистой культуры подвижных видов бактерий используют метод Мечникова и Шукеви-ч а. Каплю исследуемого материала помещают на дно пробирки со скошенным агаром (обязательно в конденсационную воду). Если в смеси с разными бактериями будет находиться подвижный вид микроба (протей, столбнячная палочка и др.), то через 12... 18 ч на поверхности агара появляется рост бактерий искомого вида, пересевом которого с самой верхней части агара достигается получение чистой культуры. Для выделения анаэробов посевы на средах в пробирках, чашках Петри помещают в эксикатор или анаэростат.

Биохимические свойства микробов. Для описания и идентифи­кации микроорганизмов широко используют некоторые особен­ности их обмена веществ, выявляемые по способности расти на диагностических средах и вызывать те или иные превращения ве­ществ, входящих в состав этих сред. К биохимическим признакам, которые, как правило, необходимы при определении системати­ческого положения различных представителей бактерий, относят способность использовать углеводы, сахара и спирты. Микроорга­низмы характеризуются неодинаковой способностью использо­вать различные углеводы и спирты в качестве единственных ис­точников углерода и энергии.

Для идентификации большинства гетеротоофных микроорга­низмов необходимо определить, какие углеводы и спирты обеспе­чивают рост изучаемого организма и какими изменениями среды он сопровождается. Как правило, для этих целей используют сле­дующие углеводы — арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, га­лактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, а также спирты— глицерин и маннит. Рост на средах с этими соединениями может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов, газов.

Образование кислот регистрируют по изменению активной кислотности (рН) среды, газа —по появлению на поверхности среды пены и вытеснению среды из поплавка. Углеводы или спир­ты составляют 1 % основного состава среды. Основой (фоном) среды является водопроводная вода; в нее входят 0,5 % пептона и 0,1 % КНРО₄. Чтобы обнаружить изменение рН, к среде добавля­ют индикатор бромкрезолпурпур из расчета 2 мл 1,6%-го спирто­вого раствора на 1 л среды: при рН 6,8 индикатор имеет пурпур­ный, а при рН 5,2 —желтый цвет. Вместо бромкрезолпурпура можно использовать в такой же концентрации бромтимолблау, который при рН 6,0 дает желтый цвет, а при рН 7,6 — синий.

Чтобы обнаружить образование газа, в среду опускают поплав­ки (трубочки диаметром 5...7 мм и длиной 35...45 мм, запаянные с одного конца) запаянным концом вверх. Как правило, готовят ос­новной фон среды, добавляют к нему индикатор; при необходи­мости доводят рН среды до 6,8 и разливают в пробирки с поплав­ками (по 9 мл в каждую); стерилизуют при 98,06 кПа.

Углеводы и спирты следует стерилизовать отдельно в виде 10%-х водных растворов и Добавлять после стерилизации к стерильному фону среды. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать фильтро­ванием, чтобы избежать их гидролиза при высокой температуре. Во все среды с углеводами и спиртами одновременно вносят по 0,1...02 мл суспензии клеток изучаемого микроорганизма и ставят в термостат.

Если изучаемый организм развивается быстро, то результаты можно учитывать через 48...96 ч, а если медленно — через 7...10сут. Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка отмечают рост или его отсутствие во всех использованных средах. По изменению цвета индикатора делают заключение о том, чем сопровождается использование субстратов — подкисле-нием или подщелачиванием среды, или рН среды не изменяется (цв. рис. IV). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке. Результаты сравнивают с контрольной средой, т. е. с фоном, не содержащим ни углеводов, ни спиртов. Все данные на­блюдения вносят в таблицу. На основании полученных результа­тов делают заключение о том, какие углеводы и спирты использу­ет изучаемый микроорганизм и сопровождается ли этот процесс накоплением кислоты или образованием газа.

Аэробное окисление или сбраживание-углеводов. Это различие в метаболизме углеводов использу­ют при характеристике многих представителей гетеротрофных микроорганизмов. Среду (состав: пептон — 0,2 г, NaCl — 0,5 г, КНРО₄ — 0,03 г, вода дистиллированная — 100 мл, агар-агар — О,3г, бромтимолблау — 0,3мл 1%-го водного раствора; рН 7,1) разливают в пробирки.

Углеводы готовят в виде 10%-х растворов, стерилизуют отдельно и вносят в среду после стерилизации так, чтобы их конечная кон­центрация соответствовала 1 %. Для каждого углевода используют две пробирки. После посева поверхность среды в одной пробирке заливают стерильным парафином или смесью вазелинового масла и парафина (1: 1). Продолжительность культивирования составляет 8...10сут. Образование кислоты регистрируют по изменению цвета индикатора. Организмы, осуществляющие брожение, развиваются и подкисляют среду в двух пробирках, тогда как организмы, осуще­ствляющие аэробное окисление, — только в одной.

Гидролиз крахмала. Микроорганизмы, образующие амилазу, используют продукты гидролиза крахмала как источник углерода и энергии. Для выявления этой способности используют среду следующего состава (%): пептон—1,0, КНРО₄ —0,5, ра­створимый крахмал —0,2, агар-агар—1,5; рН среды —6,8...7,0. Готовят 40 мл указанной среды, стерилизуют и разливают в две стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, клетки изучаемо­го организма высевают штрихом по диаметру чашки. Продолжи­тельность культивирования 7...10 сут.

Гидролиз крахмала обнаруживают по зоне просветления среды вдоль штриха. Особенно четко она видна после обработки агаро­вой пластинки раствором Люголя. Так как йод — индикатор крах­мала, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется в основном до декстрина.

Разжижение желатины. Разжижать желатину спо­собны микроорганизмы, выделяющие в среду протеолитические ферменты (коллагеназы). Для выявления этой способности иссле­дуемый микроорганизм высевают на мясопептонную желатину (МПЖ), приготовленную следующим образом: к МПБ добавляют 10...15 % желатины и оставляют на 20...30 мин, чтобы желатина на­бухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворе­ния желатины и разливают в пробирки по 8...10 мл. Стерилизуют при 4,8 Па 15 мин. Посев осуществляют уколом. Продолжитель­ность культивирования 7... 10 сут при комнатной температуре. ■ Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения. Разжижение бывает послойным, воронкообразным, мешковидным, пузырчатым {рис. 37).

Образование аммиака. Свойственно микроорганиз­мам, дезаминирующим аминокислоты. Эту способность микроор­ганизмов выявляют при их росте в -

МПБ. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8...10мл в каждую, стерилизуют при 9,8 Па и засевают клетками изучаемого микроорганизма. Образование ам­миака обнаруживают по изменению окраски лакмусовой бумаги. Для этого после посева помещают в пробирку над средой стериль­ную полоску красного лакмуса, зажимая ее между пробкой и гор­лышком пробирки. Чтобы затруднить улетучивание аммиака, пробку пробирки заворачивают в целлофан.

При образовании аммиака полоска красного лакмуса синеет. Лакмусовые бумажки стерилизуют в чашке Петри автоклавирова-нием при 4,9 Па.

Образование индола. Многие микроорганизмы в процессе развития образуют из триптофана индол, что обусловле­но их триптофаназной активностью и служит важным диагности­ческим признаком. Индол обнаруживают по качественной реак­ции с реактивом Эрлиха. МПБ с 0,01 % триптофана разливают в пробирки по 8...10 мл, стерилизуют при 4,9 Па и засевают клетка­ми изучаемого организма.

Через 5...7 сут после посева проводят качественную реакцию на присутствие индола в культуре. Для этого на поверхность среды, не перемешивая, вносят 1...2 мл реактива Эрлиха: появление крас­ной окраски свидетельствует о наличии индола. Параллельно про­водят качественную реакцию на индол в стерильной среде.

Образование сероводорода (H2S). Свойственно микроорганизмам, использующим в процессах метаболизма серо­содержащие аминокислоты, например цистеин, цистин, метио-нин. Эту способность выявляют при выращивании микроорганиз­мов в МПБ, который разливают в пробирки по 8...10 мл в каждую, стерилизуют при 4,9 Па и засевают клетками изучаемого организ­ма. После посева над средой помещают полоску бумаги, пропи­танную раствором ацетата (уксуснокислого) свинца, зажав ее меж­ду пробкой и горлышком пробирки. Пробку пробирки заворачи­вают в целлофан, чтобы затруднить улетучивание сероводорода. Продолжительность культивирования 7...10 сут.

Выделение H₂S. При развитии микроорганизмов H₂S в МПБ обнаруживают по почернению бумаги вследствие образова­ния сульфида свинца.

При развитии микроорганизмов на среде с железоаммонийным цитратом о выделении сероводорода судят по почернению среды из-за образования сульфида железа (FeS). Образование сероводо­рода характерно и для микроорганизмов, осуществляющих про­цесс сульфатредукции.

Воздействие на молоко. Молоко содержит углево­ды (лактозу), белки (казеин), витамины, минеральные соли, по­этому многие микроорганизмы хорошо в нем растут. Рост микро­организмов в молоке может быть связан со сбраживанием лакто­зы, протеолизом казеина или с двумя этими процессами одновре­менно.

Для определения воздействия микроорганизмов на молоко поступают следующим образом. Молоко обезжиривают сепари­рованием или центрифугированием в течение 15 мин при 2...3тыс. мин"'. При центрифугировании жиры образуют на по­верхности молока достаточно плотную пленку. Обезжиренное мо­локо разводят водой (4 части молока на I часть воды), добавляют индикатор бромкрезолпурпур (2 мл 1,6%-го спиртового раствора на 1 л молока) или лакмус (10 мл 4%-го раствора на I л молока), разливают в пробирки по 8...10мл в каждую и стерилизуют при 4,9 Па.

Результаты учитывают спустя 6... 14 сут после посева. Исполь­зование лактозы с образованием кислот отмечают по изменению цвета индикатора. Если степень подкисления достаточно велика, наблюдается коагуляция казеина (образование сгустка, часто со­провождаемое отделением сыворотки). Образование диоксида углерода (углекислоты) микроорганизмами в процессе использо­вания лактозы хорошо видно по сгустку, который пронизан пу­зырьками.

Воздействие микроорганизмов на казеин молока тоже вызыва­ет коагуляцию, но она имеет место при нейтральной или слабоще­лочной реакции среды и является результатом образования мик­роорганизмами казеинолитических ферментов. При высокой ак­тивности этих ферментов отмечается «просветление» молока, на­зываемое пептонизацией, что связано с протеолизом казеина.

Отношение к кислороду. По отношению к кисло­роду различают четыре большие группы микроорганизмов: обли-гатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы (аэро­бы) и облигатные анаэробы.

Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации ограничиваются наблюдением роста изучаемого организма после посева уколом в агаризованную среду или после посева в расплав­ленную агаризованную среду. Строгие аэробы растут на поверхно­сти среды и в самом верхнем ее слое, микроаэрофилы — на неко­тором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэро­бы развиваются по всей толще среды, облигатные анаэробы — только в глубине среды.

Чтобы определить принадлежность изучаемого микроорганиз­ма к одной из вышеуказанных групп, поступают следующим обра­зом. МПА (или другую, благоприятную для микроорганизма сре­ду) разливают в четыре пробирки на 1/2 ее высоты и стерилизуют при 30 Па. В две пробирки с МПА посев проводят уколом. В двух других пробирках МПА расплавляют в кипящей водяной бане и дают остыть до 48...50 X, а затем в среду вносят петлей исследуе­мый материал, тщательно перемешивают и дают агару застыть.

Отмечают рост и его интенсивность по уколу и в толще среды. В соответствии с этим характеризуют отношение исследуемого микроорганизма к кислороду.

Оксидазная активность. Этот тест используют обычно для дифференциации представителей семейства Pseudomonadaceae от других палочковидных бактерий, не окраши­вающихся по Граму. Для определения оксидазной активности на­носят несколько капель 1%-го водного раствора тетраметилфени-лендиамина на колонию в чашке Петри. Колонии организмов, об­ладающих оксидазной активностью, приобретают красную окрас­ку, которая через 10...30 мин переходит в черную.

Каталазная активность. Свойственна большинству аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и многие микроаэрофилы каталазу не образуют. Каталазную активность выявляют следующим образом. Исследуемый микроорганизм выращивают на поверхности плотной питательной среды. Нано­сят каплю 10%-го раствора Н₂О₃ на колонию или суспендируют клетки исследуемого микроорганизма в небольшом объеме этого раствора. Выделение О2, хорошо заметное по образованию пу­зырьков, свидетельствует о наличии в клетках каталазы. Можно выращивать бактерии и в жидкой среде. В этом случае к 1 мл жидкой культуры добавляют I мл раствора НгО^: значение рН должно быть около 7.

Отношение к температуре. Подавляющее боль­шинство микроорганизмов, с которыми имеют дело в лаборатор­ных условиях, принадлежат к мезофилам. Однако оптимальная температура для роста микроорганизмов этой группы имеет доста­точно широкий диапазон— от 20 до 45 °С. Поэтому необходимо определить температуру, обеспечивающую оптимальный рост изу­чаемого организма.

Для этого штрихом засевают скощенные плотные питательные среды в 10 пробирках. Пробирки затем по две помещают в термо­статы с температурой 20, 30, 37, 42 и 48 °С. Через 2...3 сут отмеча­ют интенсивность роста исследуемого макроорганизма визуально по 4-балльной шкале: 0 —отсутствие роста, «+» —слабый рост, «++» —хороший рост; «+++» — очень хороший рост.

После первого пассажа проводят второй пассаж с той лишь раз­ницей, что для каждой температуры посевным материалом служат клетки соответствующего первого пассажа. Пробирки вновь поме­щают в термостаты с различной температурой; через 2...3 сут отме­чают рост и его интенсивность.

Чаще используют следующие методы регистрации фермента­тивной активности микроорганизмов.

Выявление сахаролитической активнос­ти микроорганизмов. В состав дифференциально-ди­агностических углеводных сред (среды Гисса) входят различные со­единения, которые можно условно назвать сахарами: моносахари­ды, полисахариды, многоатомные спирты. При утилизации углево­дов в качестве конечных продуктов образуются кислоты и газообразные продукты. Соответственно расщепление углевода регистрируют по изменению рН среды и выделению газообразных продуктов. Закисление питательной среды улавливают при помощи различных индикаторов. Индикатор ВР, входящий в состав сухих сред Гисса, меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.

Индикатор Андрэдэ (кислый фуксин— 0,5 г, 1%-й раствор гид-роксида натрия — 16 мл, дистиллированная вода — 84 мл) при за-кислении дает покраснение среды. В жидких средах Гисса образо­вание газов при утилизации субстрата улавливают при помощи поплавков («газовок») — стеклянных трубочек, запаянных в верх­нем конце и помещенных в пробирки. В «газовках» скапливаются газы, вытесняющие жидкую питательную среду; в полужидких средах Гисса газообразные продукты остаются в толше среды в виде пузырьков.

Ферментация углеводов иногда происходит медленно, поэтому предварительный учет результатов проводят через 24...48 ч, а окончательный — через 1О...14сут инкубирования посевов.

Тест с метиловым красным показывает степень закисления сре­ды при расщеплении глюкозы. Метилрот как индикатор срабаты­вает в диапазоне рН 4,4...6,0. Исследуемую культуру выращивают 2...5сут в жидкой среде Кларка с глюкозой. Затем на 5 мл среды добавляют 5...6 капель раствора метилрота. Положительный ре­зультат — покраснение среды после внесения индикатора (рН 4,0...5,0).

Среда Кларка: пептон —5 г, гидрофосфат калия —5 г, глюко­за — 5 г, вода дистиллированная — 1000 мл. Ингредиенты раство­ряют в воде, кипятят 2...3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, доводят рН до 6,9...7,0, разливают по пробиркам и стери­лизуют при 112 °С 20 мин.

Тест Фогеса — Проскауера выявляет промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкарбинол, диметил-кетон). Исследуемую культуру выращивают на среде Кларка. К 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 5%-го раствора анафтола, перемешива­ют, вносят 0,2 мл 40%-го раствора гидроксида калия и инкубируют 1 ч. Положительная реакция — красное окрашивание среды.

Выявление протеолитических и других ферментов микроорганизмов. Протеолитические ферменты расщепляют белки питательной среды до промежуточ­ных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (се­роводород, индол, аммиак) продуктов.

Характер роста микроорганизма на молоке. При посеве исследу­емой культуры бактерий на стерильное обезжиренное молоко можно выявить фермент, расщепляющий молочный сахар (лакто­зу), и протеолитические ферменты, действующие на молочный белок (казеин). Расщепление лактозы приводит к закислению и свертыванию молока, при выделении протеолитических фермен­тов казеин постепенно растворяется — пептонизируется, в результате чего молоко просветляется, приобретает легкий кремовый от­тенок, а на дне пробирки формируется осадок. Свертывание мо­лока может также происходить под влиянием выделяемого неко­торыми бактериями «сычужного» фермента, в этом случае реак­ция молока бывает щелочной. Иногда возможна пептонизация ка­зеина без свертывания молока.

Тест на гидролиз казеина в плотных питательных средах. Обез­жиренное молоко диализуют для удаления лактозы, которая инги-бирует гидролиз казеина. В расплавленный питательный агар с двойной концентрацией агар-агара добавляют равный объем сте­рилизованного автоклавированием диал изо ванного молока. Ис­следуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на поверхность питательной среды, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют до 14сут. Перед учетом результатов поверхность среды заливают 10%-м раствором соляной кислоты. Положительный результат — просветление среды вокруг колоний.

Тест на уреазу. Исследуемую культуру микроорганизма засева­ют на среду Кристенсена (пептон — 1 г, хлорид натрия — 5 г, ди-гидрофосфат калия —2 г, агар —20г, глюкоза— 1 г, 0,2%-й ра­створ фенолрота —6мл, 20%-й раствор мочевины— 100мл, вода дистиллированная —1000 мл) и выращивают 1...4сут. Положи­тельный результат — покраснение среды в результате ее защелачи-вания.

Тест на редукцию нитратов. Выявляет восстановление нитра­тов до нитритов. Культуру микроорганизма засевают в МПБ, со­держащий 0,2% нитрата калия, инкубируют 48...12 ч. Затем в опытную и контрольную пробирки добавляют по 1 мл реактива с крахмалом (растворимый крахмал — I г, вода дистиллированная— 100 мл, йодид калия — 0,5 г). К этому раствору перед постановкой реакции добавляют несколько капель 10%-го раствора соляной кислоты. Положительный результат-—темно-синее окрашивание.

Тест на общую фосфатазу. Исследуемую культуру микроорга­низма засевают «штрихом» на поверхность питательного агара с натриевой солью дифосфата фенолфталеина, инкубируют 4...5 сут. Чашки переворачивают вниз крышкой, на внутреннюю поверх­ность которой наносят каплю 28...30%-го раствора нашатырного спирта. При наличии фосфатазы колонии приобретают красный цвет.

Тест на оксидазу. Фильтровальную бумагу пропитывают 1%-м раствором тетраметилпарафенилендиамина дигидрохлорида. Бак­териальную массу петлей наносят на поверхность бумажной по­лоски. Положительный результат — фиолетовое или пурпурное окрашивание через 10...60 с.

Определение гемолитических свойств. Некоторые виды бактерий в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают особые веще­ства белковой природы —гемотоксины, обладающие лизирую-щим действием на эритроциты. Для определения гемолитической способности производят посевы на питательные среды, содержа­щие 5 % дефибринированной крови. Чаще используют кровяной МГЛА. При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладаю­щих гемолитическими свойствами, вокруг колонии в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких питательных средах при гемолизе среда делается прозрачной (красная лаковая кровь).

Тест на редуцирующую способность бак­терий (в метиленовом молоке) основан на следующей особен­ности: при окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются. Такие свойства отмечены у лакмусовой настойки, метиленовой сини, малахитового зелено­го и др. Например, молоко с метиленовой синью готовят так: мо­локо подщелачивают 10%-м раствором карбоната натрия до рН 7,2 и добавляют 20 мл 1%-го водного раствора метиленовой сини на 1000 мл. Готовая среда голубого цвета. Результат учитывают че­рез сутки инкубирования посевов. В случае редукции красителя среда окрашена в кремовый цвет.

Тест-системы для быстрой идентифика­ции бактерий по группе специально отобранных биохи­мических признаков обычно представляют собой пластмассовые пластины с лунками (микропробирками), заполненными различ­ными сухими средами (субстратами). В эти среды вносят суспен­зию исследуемой культуры и после инкубирования учитывают ре­зультат. К тест-системам прилагают таблицы для учета результатов и идентификации микроорганизмов в зависимости от спектра вы­явленных ферментов.

Разработаны тест-системы для идентификации энтеробакте-рий, анаэробов, несбраживающих бактерий и т. д. Нижегородский институт микробиологии и эпидемиологии выпускает тест-систе­му подобного типа — биохимические пластины для идентифика­ции энтеробактерий (ПБДЭ), кроме того, разработаны тест-систе­мы для санитарно-микробиологических целей.

Принципы идентификации микроорганизмов. Основная задача бактериологического диагностического исследования — это опре­деление таксономического положения выделенного микроорганиз­ма путем сравнения его свойств со свойствами известных видов.

В рутинной бактериологической практике микроорганизм идентифицируют, изучая его фенотипические признаки (мор­фологические, тинкториальные, культуральные, биохимичес­кие, патогенные). Стали получать распространение некоторые методы идентификации по генотипическим признакам, кото­рые ранее в основном применяли в научной работе для класси­фикации микроорганизмов с неясным таксономическим поло­жением.

В бактериологии для идентификации используют определите­ли микроорганизмов. Наиболее популярный — определитель бак­терий Берджи — включает в себя описание свойств известных ви­дов микроорганизмов. Бактерии в этом руководстве по ограни­ченному числу морфологических и физиологических признаков объединены в большие группы. В пределах этих групп при помо­щи нескольких дифференцирующих признаков бактерии подраз­делены на семейства, роды и виды. Распределение микроорганиз­мов в этом определителе не отражает иерархической классифика­ции, а преследует сугубо практическую цель — как можно быстрее и экономичнее установить таксономическое положение изучаемо­го микроорганизма.

Идентификация неизвестного микроорганизма представляет собой процесс последовательного его отождествления с той или иной большой группой микробов, характеризующихся общими свойствами, затем с семейством в пределах группы, далее с тем нечном этапе исследуемый микроорганизм отождествляют (иден­тифицируют) по совокупности морфологических, тинкториаль-ных, культуральных, биохимических, патогенных свойств с ка­ким-либо видом в пределах рода. В случае необходимости внутри вида устанавливают принадлежность культуры к био-, серо-, фа-говару. Работа с определителем Берджи предполагает использова­ние достаточно большого количества тестов, характеризующих различные свойства микроорганизма. В практических диагности­ческих лабораториях, исходя из эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, обычно проводят бактериоло­гические исследования, заранее ориентированные на обнаруже­ние возбудителя определенной инфекционной болезни, по схеме, предусмотренной официальной инструкцией.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 3876 | Нарушение авторских прав