АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Индукции мутаций под действием ультрафиолетового излучения
(УФИ). Воздействие УФИ индуцирует у бактерий, в частности Е. coli, предмутационные повреждения и широкий спектр мутаций, включая замены оснований, образование делений и др.
В качестве источника УФИ используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта. Поскольку Е. coli обладает эффективными механизмами световой репарации УФ-поврсждений ДНК, то облучение желательно проводить в темноте или при красном свете. Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основании которой устанавливают оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1... 1 % от числа выживших бактерий.
Для получения lac-мутантов Е. coli испытуемую культуру предварительно выращивают в питательном бульоне в течение 14...18 ч. При этом концентрация бактериальных клеток в 1 мл среды составляет примерно 2 ■ 108. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 М раствора MgSO4 и охлаждают во льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15... 150 с, после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона. Пробирку с бульонной культурой инкубируют при 37 "С в течение 14...18ч. Затем из разведений 10~3...10~5 по 0,1мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.
Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм Е. coli В или К 12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10мкг/мл, левомицетин — 5мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.
На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные колонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентрацией антибиотика, резистентны к нему. Параллельно ставят контрольные посевы.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 586 | Нарушение авторских прав
|