АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Постановка опыта специфической трансдукции.

Реципиент — штамм Е. coli 1ас~, лишенный 3-галактозидазного оперона, конт­ролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактози-дазным опероном Е. coli. Он является дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг X dgal) с назва­нием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Се­лективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага X dgal в концентрации 10^й... 10⁷ частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависи­мости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого числа колоний. Из пробирки с разведением 10~⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверх­ности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего от­мечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению числа клеток рекомбинантов (транедуктантов), об­наруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штам­ма. Так, например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10~6 на трех чашках со средой Эндо выросло соответ­ственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штам­ма, на первой и последних чашках — 5 и 1 колоний транедуктан­тов красного цвета.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромо­сомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина. До­нор—штамм E.coli К12 Hfr leu Str1. Реципиент — штамм E.coli K12F leir Sir1". Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая: КН2РО4 — 6,5 г, MgSO4 — 0,1 г, 9(NH4);.Sa,-lr, Ca(NO3)2-0,001r, FeSO4-0,0005 г, глюкоза-2 г, стрептомицин — 200 ЁД/мл, дистиллированная вода — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульон­ной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2... 10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри: должны вырасти только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же сре­ду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не бу­дут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрепто­мицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептоми­цина, а культуру реципиентного штамма —на полную среду (пи­тательный агар) с антибиотиками для определения числа жизне­способных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют час­тоту рекомбинаций по отношению числа рекомбинантных клеток к реципиептным. Так, например, после посева 0,! мл смеси до-норных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципи­ента из разведения 10""6 —75 колоний.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 924 | Нарушение авторских прав