АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Постановка опыта специфической трансдукции.

Прочитайте:
  1. I. Постановка вопроса
  2. I. Постановка вопроса
  3. I. Постановка вопроса
  4. вого опыта.
  5. Гепатит А. Возбудитель, характеристика вириона. Способы заражения. Методы лабораторной диагностики. Проблема специфической профилактики.
  6. Гуморальные механизмы неспецифической резистентности
  7. Луи Пастер и его роль в развитии микробиологии. Разработка Пастером научных основ специфической профилактики инфекционных болезней.
  8. Методы микробиологической диагностики туляремии. Аллергическая проба, ее постановка и оценка результатов. Серологические реакции. Специфическая профилактика туляремии.
  9. Механизмы неспецифической резистентности.
  10. Необходимые для оценки знаний, умений, навыков и(или) опыта деятельности, характеризующие этапы формирования компетенций

Реципиент — штамм Е. coli 1ас~, лишенный 3-галактозидазного оперона, конт­ролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактози-дазным опероном Е. coli. Он является дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг X dgal) с назва­нием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Се­лективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага X dgal в концентрации 10й... 107 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависи­мости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого числа колоний. Из пробирки с разведением 10~6 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверх­ности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего от­мечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению числа клеток рекомбинантов (транедуктантов), об­наруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штам­ма. Так, например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10~6 на трех чашках со средой Эндо выросло соответ­ственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штам­ма, на первой и последних чашках — 5 и 1 колоний транедуктан­тов красного цвета.

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромо­сомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина. До­нор—штамм E.coli К12 Hfr leu Str1. Реципиент — штамм E.coli K12F leir Sir1". Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая: КН2РО4 — 6,5 г, MgSO4 — 0,1 г, 9(NH4);.Sa,-lr, Ca(NO3)2-0,001r, FeSO4-0,0005 г, глюкоза-2 г, стрептомицин — 200 ЁД/мл, дистиллированная вода — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульон­ной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2... 10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри: должны вырасти только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же сре­ду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не бу­дут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрепто­мицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептоми­цина, а культуру реципиентного штамма —на полную среду (пи­тательный агар) с антибиотиками для определения числа жизне­способных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют час­тоту рекомбинаций по отношению числа рекомбинантных клеток к реципиептным. Так, например, после посева 0,! мл смеси до-норных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципи­ента из разведения 10""6 —75 колоний.


Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 872 | Нарушение авторских прав







При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.004 сек.)