Тема 10. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Для оценки санитарно-гигиенического состояния различных объектов окружающей среды предназначены санитарно-бактерио-логические исследования, целевое назначение которых состоит в определении эпизоотической безопасности. Выявление патогенных микроорганизмов служит показателем эпизоотической опасности. Однако прямое обнаружение их сопряжено с рядом трудностей, связанных прежде всего с низкой концентрацией данных микроорганизмов, которые, как правило, медленно размножаются в воде, почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике применяют косвенные методы, основанные на определении микробной обсемененности того или другого объекта и на обнаружении в нем так называемых санитарно-показательных бактерий.
О микробной обсемененности судят по микробному числу — общему количеству микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 см3 воды, 1 г почвы, 1 м3 воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оценивают по двум показателям — титру и индексу. Титром называется тот минимальный объем или масса, в которых обнаруживаются данные бактерии; индексом — число санитарно-показатель-ных бактерий, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 м3 воздуха.
К санитарно-показательным бактериям принадлежат представители облигатной микрофлоры организма животных, для которых средой обитания служат кишечник или дыхательные пути. Они обладают следующими свойствами: 1) постоянно выделяются в большом количестве с калом или капельками слизи из дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или дыхательных путях; 4) неспособны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойства. Все перечисленные признаки присущи ряду бактерий, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды.
Санитарно-показательные бактерии группы кишечных палочек (БГКП) принадлежат к разным родам семейства энтеробактерий. Их дифференцируют по различным признакам.
Обнаружение Е. coli в разных объектах окружающей среды, пищевых продуктах считается наиболее достоверным показателем свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.
Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее загрязнении фекалиями, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде (в частности, в почве).
Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует о фекальном загрязнении.
Термофильные бактерии включают группу разных бактерий (Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus и др.), размножающихся при температуре 60 X и выше. Они не являются постоянными обитателями кишечника животных и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличение числа этих бактерий в самосогревающемся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.
Бактерии, принадлежащие к роду Proteus (P. vulgaris и др.) семейства Enterobacteriaceae, широко распространены в природе. Эти гнилостные бактерии в большом количестве встречаются на разлагающихся останках животных и растений. Обнаружение этих бактерий в каких-либо пищевых продуктах свидетельствует о гнилостном распаде.
Микрофлора воды. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, из открытых водоемов — в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10... 12 мл расплавленного и остуженного до 45...50°С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1...2 сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 "С в течение суток, а другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в I мл.
Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-mump воды измеряется минимальным количеством воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП, коли-индекс —- количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Эти показатели определяют титрационным (бродильным) методом или методом мембранных фильтров.
Титрационный метод. Производят посев различных объемов воды в глюкозопептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор глюкозы, 0,5 % раствор хлорида натрия, индикатор Анд-рэдз и поплавок), причем для посевов больших объемов (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.
Воду из открытых поверхностных водоемов исследуют в объемах 100, 10, 1 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды делают посевы из трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение суток при 37 "С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотри-цательных бактерий семейства Psendomonadaceae и других оксида-зоположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2...3 изолированные колонии с поверхности среды, наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-л-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном — она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.
Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питательный агар с 0,5%-м раствором глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической таблице 2.
Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку ЗеЙтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум~насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл; более загрязненную перед фильтрованием разводят стерильной водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают число выросших колоний, типичных для БГКП.
Из двух-трех колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диме-тил-я-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. Колонии (2...3), не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5%-м раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 °С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.
Микрофлора воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.
Седиментационный метод. Две чашки Петри с питательным агаром оставляют в помещении открытыми в течение 5...10 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37 °С. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: менее 250 колоний — воздух считается чистым; 250...500 — загрязненным в средней степени; более 500 колоний — загрязненным.
Аспирационный метод. Наиболее точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов.
Аппарат Кротова (рис. 43) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно оседают на всю поверхность среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.
Для определения микробного числа воздуха используют питательный агар, для выделения гемолитических стрептококков — кровяной агар с добавлением генци-анового фиолетового с последующим контрольным микроскопированием и выборочным пересевом подозрительных колоний на кровяной агар.
Состав сред. Кровяной агар с ген-циановым фиолетовым: 2 % питательного агара, 5...10% дефибринированной крови (лошади, кролика или барана) и генциано-вый фиолетовый (1:50 000). Желточно-солевой агар: 2% питательного агара, 10 % хлорида натрия, 20 % (по объему) желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).
Для исследования воздуха служат и другие приборы (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАЕ-1 — пробоотборник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха), в которых определенный объем воздуха пропускается через жидкости или фильтры, а затем делают мерные посевы на питательные среды. Приборами ПАБ-1 и ПОВ-I можно исследовать большие объемы воздуха и обнаруживать патогенные бактерии и вирусы. Воздух микробиологических боксов, хирургических, акушерско-гинекологических и других помещений исследуют с целью обнаружения патогенных и условно-патогенных бактерий — возбудителей инфекций (стафилококки, синегнойные палочки и другие грамотрицательные бактерии).
Микрофлора почвы. При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют микробное число, коли-титр, перфрин-генс-титр и титр термофильных бактерий. В необходимых случаях исследуют состав нитрифицирующих и аммонифицирующих бактерий, актиномицетов, грибов, целлюлозных и других микроорганизмов.
Почву для исследования берут на глубине 10...15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 101, 104, 10s. Из двух последних разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7%-го расплавленного и остуженного до 45 °С питательного агара, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2%-м питательным агаром. Посевы инкубируют при 37 X. Затем подсчитывают число выросших колоний и определяют микробное число.
Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий п о -ч в ы. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43 °С в течение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды.
Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии (1 мл) засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона—Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24...48 ч, после чего учитывают результаты по свертыванию молока или по образованию черных колоний Clostridium peifringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр.
Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии {1 мл) вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 °С, а затем подсчитывают число выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.
Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является установление степени фекального загрязнения.
Состав сред. Среда Кесслера: 1 % пептона, 5 % желчи, 0,25 % лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грам положительных бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера: 3 % питательного агара, 1 % глюкозы, 2 % сульфита натрия, 0,08 % хлорида железа.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1096 | Нарушение авторских прав
|