Методы оценки иммунного статуса макроорганизма.
Работа иммунной системы, как и любой другой системы организма, может нарушаться, что неизбежно повысит восприимчивость животного к инфекционным заболеваниям.
Методы оценки Т-системы иммунитета (клеточный иммунитет). Из числа существующих методов оценки Т-иммунитета наиболее известны следующие.
Метод «спонтанных розеток» (Е—РОК). Т-лим-фоциты несут на своей поверхности рецепторы, реагирующие с мембранными структурами эритроцитов барана. После сорбции эритроцитов Т-клетки приобретают форму «розетки», что позволяет выявлять их в популяции лимфоцитов. Реакцию проводят в 3 этапа.
Выделение лимфоцитов барана: в центрифужную пробирку наливают 2 мл разделяющего раствора, состоящего из 9%-го водного раствора фиколла и визотраста-370, доведенного до плотности 1,077 г/мл (соотношение 8: 2). Затем на разделяющий раствор осторожно наслаивают 2...4 мл крови с гепарином (100 МЕ/мл), разведенной средой Игла в соотношении 1: 2...1:4. Смесь центрифугируют при 600 мин~1 и температуре 20 °С. Лимфоциты, сконцентрированные в виде беловатого слоя над разделяющим раствором, отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла (при 600 мин""1 — 10 мин два раза, 200 мин"1 — 10 мин один раз).
Инкубация средой Игла: концентрацию лимфоцитов доводят до 3 ■ 106/мл. Готовят суспензию эритроцитов барана: эритроциты отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия (три раза), затем из них готовят 0,5%-ю суспензию в среде Игла. Далее смешивают по 0,5 мл суспензии лимфоцитов и эритроцитов, смесь центрифугируют при 200 мин"1 в течение 5 мин и оставляют при 4 °С на 18 ч.
Учет реакции: осторожно покачивая пробирку, ресуспендиру-ют осадок (не перемешивая), каплю суспензии вносят в счетную камеру и исследуют методом фазою-контрастной микроскопии. Просматривают не менее 200 лимфоцитов и подсчитывают те клетки, к поверхности которых прикреплено более трех эритроцитов — естественные розеткообразующие клетки (Е—РОК).
Технология выращивания животных отражается на их физиологическом состоянии и на количестве Т- и В-клеток в частности.
Выявление Т-хелперов и Т-супрессоров. Т-хелперы и Т-супрессоры несут на своей поверхности специфические антигены, которые можно обнаружить при помощи мышиных моноклональных антител в реакции непрямой иммунофлуо-ресценции. Лимфоциты, связавшие моноклональные антитела, светятся по периферии клеток, что позволяет определить их количество при микроскопическом исследовании.
Методы оценки В-системы иммунитета (гуморальный иммунитет/ Включают в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержание в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител.
Количественное определение иммуноглобулинов разных классов методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результате реакции антиген — антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жидкости.
В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение) антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов в стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.
Используют 3%-й агар Дифко на веронал-мединаловом буфере с рН 7,3...7,4 (мединал — 35,4г, веронал — 5,25 г, дистиллированная вода —до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9 х 12 см, на одно из них помещают П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки, оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15...20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.
В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (igG, IgA) или 48 ч (IgM).
Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандартной сыворотки, на оси ординат —значения концентраций иммуноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина.
Все методы определения В-лимфоцитов в крови основаны на выявлении на поверхности В-лимфоцита структур, специфических только для В-клеток: рецепторы к (^-фрагменту иммуноглобулинов, рецепторы к Сз-фракции комплемента, иммуноглобулиновые рецепторы, а также специфические В-антигены.
Метод розеткообразования (ЕАС—РОК). Эритроциты барана обрабатывают антителами гемолизина, затем комплементом. Образуется комплекс АГ—AT—С, содержащий компонент комплемента С3-фракции. Далее смешивают лимфоциты животного и обработанные эритроциты барана. Эритроциты за счет присутствующих на их поверхности молекул С3 избирательно сорбируются на В-лимфоцитах, образуя «розетки».
Другие методы основаны на выявлении рецепторов к Рс-фрагментам иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых детерминант на поверхности В-клеток. Рецептор к Рс-фрагменту иммуноглобулинов способен связывать агрегированный у-глобулин, меченный флуорохромом, что можно в последующем установить при помощи флуоресцентного анализа.
Используют меченные флуорохромом антиглобулиновые сыворотки или антисыворотки против иммуноглобулинов отдельных классов, например моноклональные антитела.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 593 | Нарушение авторских прав
|