АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Реакция связывания комплемента (РСК).
В основе реакции лежат два явления — бактериолизис и гемолиз. В их проявлении участвует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: 1) обеспечивает феномен бактериолизиса и используется для диагностических целей; 2) гемолитическая, индикаторная, вспомогательная; позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе (см. схему цв. рис. I). Ранее в качестве антигена использовали взвесь бактерий, поэтому первая система была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).
Постановку РСК осуществляют в два этапа. На первом этапе готовят бактериолитическую систему: в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки с антигеном, добавляют комплемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген — сыворотка—комплемент (бактериолитическая система) выдерживают в водяной бане (или термостате) 20...40 мин при 37...38 "С. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, осуществляют второй этап реакции: в пробирки добавляют компоненты гемолитической системы — отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку, как показано в схеме. Все компоненты бактериолитической системы встряхивают для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню при 37...38 "С на 20...40 мин. Затем добавляют компоненты гемологической системы, вторично все встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 10...15 мин.
Предварительный учет результата. Если сыворотка получена от больного животного, то в ней содержатся антитела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген — антитело) связывается комплемент — гемолиз не происходит, результат положительный.
В сыворотке от здорового животного антитела отсутствуют: комплекс антиген — антитело не образуется, комплемент в бактериологической системе не связывается. При добавлении эритроцитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комплемент реагирует с этим комплексом — произойдет гемолиз, результат отрицательный (см. цв. рис. II).
Окончательный учет результата. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15...20 ч. Если в бакте-риолитической системе сыворотка была от больного животного, в пробирке образуется специфический комплекс антиген — антитело, который адсорбирует (связывает) весь добавленный комплемент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемолиза не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надоса-дочная жидкость прозрачная. Результат РСК положительный.
Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), в бактериолитической системе комплекс антиген — антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, а остается свободным. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин —эритроциты), происходит гемолиз эритроцитов — осадок не образуется, жидкость в пробирке лаково-красного цвета. Результат РСК отрицательный.
РСК. используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической иммунной сыворотки.
Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, поступившие для исследования; две сыворотки, заведомо позитивные (стандартные, обеспечивающие положительный результат), и две нормальные сыворотки. Все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют при 56...58 °С 30 мин; антиген в разведении согласно титру; комплемент, разведенный в соответствии с установленным титром при титровании в бактериолитической системе; гемолизин в рабочем титре; эритроциты барана (I: 40); физиологический раствор, градуированные пипетки, пробирки, штативы, водяную баню на 37...38 °С.
Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эритроциты отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, которую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5 %). Антиген разводят согласно титру, указанному на этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.
Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей {или вируссодержа-гдей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим действием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1...2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроцитов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабрика указывает, что он предназначен для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке указаны номер серии, дата изготовления, срок годности, активность антигена, то есть в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100, 1:150 и др.). При некоторых заболеваниях антигеном служат другие материалы; например, для диагностики перипневмо-нии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интра-плеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрования.
Испытуемые сыворотки, поступившие для исследования, разводят физиологическим раствором 1: 5 или 1: 10, инактивируют прогреванием в водяной бане для разрушения собственного комплемента 30 мин при 56...58 "С (сыворотки ослов, мулов, лошаков — при 61 °С).
Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кроликам внутривенно вводят 4...5 раз с 2...3-дневными интервалами 40...50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.
Схема титрования гемолизина. Необходимо подготовить: i) разведение комплемента 1: 20; 2) гемолизин 1:100 (0,2 мл гемолизина+9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1:40; 4) физиологический раствор NaCl.
Для постановки реакции титрования в штативе размещают два ряда пробирок — один вспомогательный только для приготовления разведений гемолизина, второй — собственно для титрования. В первую пробирку каждого ряда вносят исходное разведение гемолизина 1: 100, а затем производят последовательное разведение. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38°С на 10...15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, составляет 1: 2000, т. е. это его фактический титр. Рабочий титр в 2 раза концентрированнее — 1:1000.
По 0,5 мл (указано стрелками) каждого разведения из пробирок первого ряда переносят в отдельные пробирки второго ряда. Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента (1: 20), по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-я взвесь, или 1: 40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составлял 2,5 мл.
Примечание. Исходя из того что в окончательной постановке РСК будут участвовать 5 компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл, на протяжении всей работы этот объем соблюдается.
Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10...15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с большим содержанием гемолизина (наименьшим его разведением — 1: 500, 1:1000...). Наименьшее количество гемолизина (наибольшее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в 2 раза концентрированнее, то есть в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, если фактический титр I: 2500 (или 1: 2000), то рабочий титр соответствует разведению 1:1250 (или 1: Ш00).
К о м п л е м е н т —это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и человека); открыт Бухнером (1889). У насекомых комплемент отсутствует. Комплемент — вещество белковой природы, сложной структуры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хранении, воздействии ультрафиолетового излучения, сильном встряхивании, фильтрации через керамические фильтры, добавлении каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дистиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать добавлением на 100 мл сыворотки морской свинки 5 г сульфата натрия, 4 г борной кислоты. Активность комплемента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консервирования — высушивание в условиях вакуума при низкой температуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК активность комплемента проверяют титрованием, то есть определяют его титр — оптимальное количество, необходимое для данной реакции. Комплемент титруют дважды: в гемолитической и бактери-олитической системах.
Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1: 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно рабочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физиологический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с интервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добавляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и проводят учет результата.
Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз (в данном примере — 0,25 мл), принимают за титр комплемента.
Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наибольшим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.
Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1: 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; начинают с количества, принятого за титр в гемолитической системе, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.
После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сыворотками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сыворотки—по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой позитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемента), называют титром комплемента, который используют в постановке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.
Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют антиген — 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, добавив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.
. Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разведенная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический антиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) гемолизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуемых сывороток в качестве контроля используют заведомо позитивную сыворотку (дающую положительный результат) и нормальную (от здорового животного, дающую отрицательный результат).
Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.
Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют компоненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.
До получения окончательного результата пробирки оставляют при комнатной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без антигена, независимо, от больного или от здорового животного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антигеном более четкий результат выражен при отстаивании.
Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыворотками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех пробирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).
Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.
Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели положительного результата реакции: + + + + (///) — полное осаждение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцветная, + + + (///) — жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обозначают + + — (++), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) — отрицательный результат.
Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной классической РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной температуре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемолитическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффективность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).
Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реакция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент — стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.
Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют комплемент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемолитическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемолиза—результат отрицательный, потому что испытуемая сыворотка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция между антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной специфической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе — происходит гемолиз, результат реакции положительный по отношению к исследуемой сыворотке.
Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.
Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.
Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.
Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген — немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.
Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.
Методика и м м у н о л ю м и н е с u e н т н о и микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресценна), либо красное (краситель на основе родамина).
Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол — 15 мин, метанол — 5 мин, ацетон — 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА (одноступенчатый, двухступенчатый, трехступенчатый). Обработку препаратов люминесцирующими сыворотками, а также немечеными сыворотками первой ступени и комплементом проводят при 37 X в условиях влажной камеры {чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой).
Одноступенчатый вариант. На предметное стекло с фиксированным исследуемым материалом наносят люминесцирующую сыворотку (в разведении, указанном на ампуле). Препарат помещают во влажную камеру на 15...20 мин при 37 "С. Затем его промывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) в сосуде, меняя раствор через 5...10 мин несколько раз, или под струей водопроводной воды в течение 3...5 мин. Вода должна быть нейтральной и не содержать железа. Затем препарат (на одном стекле может быть несколько мазков) подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой, после чего наносят каплю забуференного глицерина с рН 8,0 и покрывают покровным стеклом. На покровное стекло наносят иммерсионную нефлуоресцирующую жидкость и микроскопируют.
Двухступенчатый вариант. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Затем его промывают, как описано выше, подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антиви-довой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Повторяют процедуру промывания и высушивают фильтровальной бумагой. Наносят забу-ференный глицерин, покрывают покровным стеклом, наносят нефлуоресцирующую иммерсионную жидкость и микроскопируют.
Трехступенчатый вариант (антикомплементарный). На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают и на мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную камеру и в термостат на 15...20 мин, после чего промывают и наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Последующие процедуры аналогичны одноступенчатому варианту.
Приготовление и обработка контрольных препаратов. 1. Для прямого варианта с целью определения специфичности реакции между антигеном с люминесцирующей сывороткой следует этой же сывороткой обработать препараты-мазки из гетерологичных видов микробов. Эти виды должны быть близкие в антигенном отношении, но отличающиеся по морфологии от исследуемых микроорганизмов; далекие в антигенном отношении к исследуемым микроорганизмам, но сходные по морфологии и распространению с ними. Препараты-отпечатки обрабатывают люминесцирующей нормальной сывороткой.
2. Для непрямого варианта необходимо иметь три контрольных препарата, обработанных нормальной сывороткой, люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыворотки и люминесцирующей антивидовой сывороткой с заведомо иммунной сывороткой первой ступени.
3. Для непрямого варианта с комплементом необходимы контрольные препараты, при обработке которых иммунная сыворотка заменена нормальной сывороткой того же вида и в тех же разведениях, а также препараты, обработанные всеми ингредиентами, кроме иммунной сыворотки.
Оценка результатов. Учитывают яркость, цвет, локализацию и структуру свечения. Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, меченной изотиоцианатом флуоресце-ина, имеют яркое зеленое свечение по периферии в виде ободка или ореола, центральная часть светится слабо. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, когда все тело клетки светится равномерно. Чем более выпукло лежит бактерийная клетка в препарате, тем резче ободок. Объяснить такое свечение можно тем, что с единицы площади «периферии» клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной части клетки микроба. Следует иметь в виду, что у пластичных клеток (лептоспиры, вибрионы) нет контура или он заметен слабо. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.
Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой системе: + + + + — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; + + + — яркая флуоресценция периферии клетки; + + — слабое свечение периферии клетки; + — нет контрастного свечения периферии тела микробной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают «—» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей положительным результатом чаще всего считают специфическое свечение бактерийных клеток не ниже чем на четыре или на три креста.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 3934 | Нарушение авторских прав
|