Иммуноферментный метод.
Предназначен для выявления и идентификации микрорганизмов и антител к ним. Различают две разновидности иммуноферментного метода: гомогенный и гетерогенный.
Гетерогенный метод (иммуносорбентный ELISA-тест) и РЭМА —реакция энзиммеченых антител (или антигенов), адсорбированных на поверхности водонерастворимых полимеразных материалов. При гомогенном иммуноферментном методе не используется твердая фаза; предназначен в основном для определения низкомолекулярных антигенов (гормонов, лекарственных препаратов).
Основные компоненты для твердофазного иммуноферментного метода:
1. Специфические иммуноглобулины (выделяют из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой).
2.Антивидовые глобулины (выделяют из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей очистой).
3.Белок А (выделяют из золотистого стафилококка) или бычий сывороточный альбумин.
4.Антиген (готовят из органов зараженных животных). Заведомо положительные или отрицательные антигены.
5.Фермент пероксидаза (выделяют из хрена).
6.Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителом или антигеном методом периодатного окисления).
7.Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и пероксид водорода или ортофенилендиамин и пероксид водорода).
8.Детергент (поверхностно-активные вещества: твин-20, -80, тритон Х-100, сорбитальс-20).
9.Иммунологический планшет (планшет из прозрачного полистирола).
10. Шприц-дозатор (для внесения ингредиентов реакции). Существуют прямой и непрямой методы постановки реакции.
На практике в основном используют непрямой метод.
Определение антигена иммуноферментным методом. Перед постановкой реакции лиофилизированные компоненты растворяют в объеме, указанном на этикетке, 0,01 М раствором фосфатного буфера или дистиллированной водой и доводят до объема рабочих разведений. Объем компонентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет 0,1 мл.Этапы постановки реакции:
1. Сенсибилизация планшета. В лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с антителами инкубируют в термостате 3 ч при 37 "С или 18 ч при 4 °С. По окончании инкубации планшеты промывают раствором фосфатного буфера с твином (ФБТ) 3...4 раза, предварительно встряхнув содержимое лунок. Остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.
2. Внесение антигенов. В лунки планшета, сенсибилизированные специфическими антителами, вносят контрольные положительный и отрицательный антигены и исследуемую пробу в разведениях от 1:10 до 1:1280 и инкубируют в термостате 1 ч при 37 °С. По истечении срока инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге.
3. Внесение пероксидазного антивидового конъюгата в разведеия с целью выявления комплекса антиген + антитело. Залитые планшеты помещают на 1 ч в термостат при 37 "С. Затем лунки трехкратно отмывают раствором ФБТ и подсушивают.
4. Внесение субстратной смеси. Для проявления реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксидазы) — ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-й раствор пероксида водорода для выявления комплекса антиген + + антитело + конъюгат. Планшеты закрывают и оставляют в тем ном месте при комнатной температуре на 15...30 мин.
5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке реакцию учитывают по числу крестов: ++++ —-интенсивное окрашивание;
+++ — оранжевое окрашивание;
++ — бледно-оранжевое окрашивание;
+ — желтое окрашивание.
Пробу считают положительной при оценке в два креста и более. За титр антигена принимают наивысшее разведение, при котором в реакции со специфическим антителом наблюдается бледно-оранжевое окрашивание (++), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.
При спектрофотометрическом учете результатов реакции производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном (ОП1) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП2). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1, и отрицательной, если ниже 2,1.
Техника постановки иммуноферментного метода для обнаружения (или титрования) антител выполняется так же, как при обнаружении и идентификации микробного антигена, с той разницей, что материалом служит исследуемая сыворотка крови.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 700 | Нарушение авторских прав
|