АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Иммуноферментный и радиоиммунный анализ: сущность, условия, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.
Иммуноферментный анализ. Один из наиболее распространенных в практике методов — иммуноферментный анализ (ИФА) — основан на использовании двух разных по специфичности моноклональных антител против двух разных антигенных эпитопов в составе искомого антигена. В лунки с иммобилизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген—антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избытка конъюгата антител с ферментом определяют количество связавшихся антител по их ферментативной активности в присутствии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко распространенного в литературе названия "сэндвич"-метод.
Повышение специфичности и чувствительности иммуно- ферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно- клональных антител (МКАТ).
Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки погибают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутствия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от миеломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов — способность к синтезу антител соответствующей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибридом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антигеном. После выявления клеток, секретирующих нужные антитела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генетически идентично: одна клетка дает один клон, который продуцирует МКАТ.
Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который может быть использован для количественного определения любого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.
Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очищенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего 1251. В этом случае используют конкурентный вариант связывания, когда для определения количества антигена в исследуемом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген—антитело выделяют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактивностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Использование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.
Более современный метод — твердофазный РИА, при котором специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стандартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить количество исследуемого антигена.
РИА широко применяют для количественного определенияразличных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адренокортикотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, эстрогена), белков сыворотки крови (IgE, а-фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, морфина), микробных антигенов (HBsAg).
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 862 | Нарушение авторских прав
|