АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Иммунолюминесцентный метод: сущность, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.
Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувствительных методов выявления связывания антител с антигенами в клетках и тканях — иммунофлюоресцентный анализ. Специальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикрепляется химической связью к молекуле специфического антитела, не нарушая его специфичности. Часто используют краситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеленой флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю- оресцентного метода, активируются светом одной длины волны (чаще — ультрафиолетовой части спектра), а сами испускают лучи другой длины волны (видимого спектра). В люминесцентном микроскопе используется в качестве источника света, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс-диагностики.
Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических антител против каждого из изучаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой иммунофлюоресцентный метод, при котором связанные с антигеном специфические антитела (немеченые) выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.
Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (например, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разложения, видимые в обычный световой микроскоп.
Для использования при электронной микроскопии антиген- специфические антитела можно метить частицами золота, локализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.
При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов (рис. 10.1.2).
Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии.
На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело
препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген—антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 2923 | Нарушение авторских прав
|