АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Постановка опыта трансформации.

Реципиент —- штамм Bacillus subtilis Str^s (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). До­нор — ДНК, выделенная из штамма В. subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлори­да магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин.

Для определения количества образовавшихся стрептомицинус-тойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для опреде­ления числа клеток реципиентной культуры готовят ее десяти­кратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10~⁵...10~° (для получения сосчитываемого числа колоний), высе­вают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина и для кон­троля—на агар со стрептомицином (реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину). Посев инкубируют при 37 "С. На следующий день учитывают ре­зультаты опыта и определяют частоту трансформации по отноше­нию количества выросших рекомбинантных клеток к числу кле­ток реципиентного штамма.

Пример. Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реци­пиентного штамма в разведении 10~^s выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантно-го штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клетки то в 0,1 мл за­сеянной культуры реципиента содержится 170 ■ 10^s жизнеспособ­ных клеток, а в 1 мл — 170 ■ 10⁶, или 1,7 ■ 10⁸. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 ■ 10².

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 832 | Нарушение авторских прав