АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Постановка опыта трансформации.
Реципиент —- штамм Bacillus subtilis Strs (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор — ДНК, выделенная из штамма В. subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.
К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин.
Для определения количества образовавшихся стрептомицинус-тойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения числа клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10~5...10~° (для получения сосчитываемого числа колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина и для контроля—на агар со стрептомицином (реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину). Посев инкубируют при 37 "С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.
Пример. Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10~s выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантно-го штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клетки то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 ■ 10s жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170 ■ 106, или 1,7 ■ 108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 ■ 102.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 874 | Нарушение авторских прав
|