АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Контрольные исследования

При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные резус-положительные эритроциты группы 0(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты группы 0(I).

О стандартных эритроцитах см. инструкцию «Взятие и учет крови, по­лучаемой от доноров малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов».

4. Особенности стандартных сывороток антирезус

Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности могут содер­жать резус-антитела разные по форме - полные (класса IgM) и неполные (класса IgG) (см. инструкцию «Исследование сыворотки на наличие резус-антител»). Каждые из этих антител активны только в особых условиях, поэтому методика определения резус-принадлежности зависит от того, какие резус-антитела находятся в стандартной сыворотке.

Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус указывается в сопроводительной инструкции.

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

Метод определения резус-принадлежности эритроцитов зависит от формы антител в стан­дартной сыворотке и способа ее изготовления.

При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.

1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации

с желатином в пробирке с подогревом при +46 – +48°С

Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов,

изделий медицинской техники

Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами;

стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;

центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;

водяная баня +46 – +48°С;

суховоздушный термостат +46 – +48°С;

10%-ный раствор желатина (желатин можно сохранять с консервантом - сульфацилом натрия (альбуцид) из расчета 100 мг альбуцида на 10 мл 10 %-го раствора желатина);

лупа с 2-4-кратным увеличением.

Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных эритро­цитов проводится в следующем порядке.

Кровь для исследования следует брать в количестве 5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.

Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое ко­личество свободных эритроцитов, которые следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сгусток для отделения большего количества эритроцитов.

Допустимо хранить кровь в течение двух суток при температуре +4^о–+8^оС.

Можно брать кровь в пробирку 10 мл с изотоническим раствором NaCl, лимоннокислого натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом случае эритроциты необхо­димо отмыть, для чего в пробирку долить десятикратный объем изотонического раствора NaCI, содержимое перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты использо­вать для исследования.

Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из места уко­ла пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с желатином в соотношении 1:2.

Техника определения

В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, а в контрольные – по 1 капле (0,05 мл) стандартных Rh+ и rh-эритроцитов.

В пробирки первого ряда добавляют по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.

Во все пробирки (в два ряда) добавляют по 2 капли (0,1 мл) 10%-го раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.

Второй ряд является контролем для исключения возможного неспеци­фического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая желатиновая проба).

Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помещают в водяную баню при +46 – +48°С на 15 минут или в суховоздушный термо­стат с той же температурой на 25-30 минут.

При извлечении пробирок из водяной бани или термостата доливают в них 5-8 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 1-2-кратно­го перевертывания пробирок.

Трактовка результатов

Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.

При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.

При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость (рисунок 1).

Рисунок 1. Результат реакции определения резус-принадлежности

методом с применением желатина

Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D – резус-отрицательными (rh-).

Однако результаты учитывают как истинные только после проверки контрольных образцов, подтверждающих специ­фичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы или группы 0(I) и на­личии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одно­именной группы или группы 0(I). В пробирках второго (контрольного) ряда агглю­тинации быть не должно.

Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда (прямая же­латиновая проба положительная) говорит о неспецифичности реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим раствором NaCI для элюирования с них аутоантител и по­вторить исследование. При сомнительном результате для определения резус-принадлежности следует применить другие методы исследования.

2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного

универсального реагента (в пробирках без подогрева)

Метод определения резус-принадлежности без подогрева позволяет быстро проводить исследование без применения особого лабораторного оборудования.

Метод основан на использовании сывороток антирезус, содержащих поликлональные неполные анти-D антитела, изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин, полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела приобретают способность агглютинировать резус-положительные эритроциты при комнатной температуре.

Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов,

изделий медицинской техники

Стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;

33%-ый раствор полиглюкина;

стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;

центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;

лупа с 2-4-кратным увеличением.

Предварительная обработка исследуемой крови не требуется. Может быть ис­пользована кровь, взятая непосредственно перед исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке после образо­вания сгустка крови, взятой без стабилизатора.

Допустимо хранить кровь в течение 2 суток при +4 – +8⁰С.

Техника реакции

В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.

Во все пробирки первого ряда вводят по 1 капле (0,05 мл) стандартного уни­версального реагента антирезус.

Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCI и по 1 капле (0,05 мл) 33%-го раствора полиглю­кина.

В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки, предназначенные для контроля, вводят стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эри­троциты.

Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно пово­рачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы со­держимое растекалось по стенкам. Такое растекание крови по стенкам проби­рок делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса анти­ген-антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду возможности замедлен­ной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 5 минут при комнатной температуре (+18^о–+22^оС).

Через 5 минут в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического 0,9%-го рас­твора NaCI и перемешивают содержимое 2-3-кратным перевертыванием проби­рок, не встряхивая.

Трактовка результатов

Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Ре­зультат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.

При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной (rh-) (рисунок 2).

Рисунок 2. Результат определения резус-принадлежности с помощью

универсального реагента

Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после про­верки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами, отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра результатов во втором контрольном ряду. Во всех пробирках второго контрольного ряда агглютинации быть не должно.

Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и, следовательно, не позволяет учесть результат исследования как истинный.

В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изото­ническим раствором NaCI для элюирования с них аутоантител и повторить иссле­дование.

В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности следует при­менить метод агглютинации в солевой среде, используя сыворотку с полными антителами.

3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в

сывороточной среде на плоскости (чашке Петри) с подогревом

Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов,

изделий медицинской техники

Стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;

стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;

пластмассовые пластины, чашки Петри;

водяная баня +46 – +48°С;

контрольная сыворотка группы АВ(IV).

Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных

эритроцитов

Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно после свертывания крови на дне про­бирки остается небольшое количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сгусток для отделения большего количества эритроцитов.

Эритроциты используют для исследования в виде 5-10%-ой взвеси в собственной сыворотке. Взвесь готовят в этих же пробирках путем встряхивания со­держимого.

Допустимо хранить кровь в течение 2-х суток при +4 – +8°С.

Техника определения

На пластмассовую пластину, чашку Петри в соответствии с маркировкой наносят по одной большой капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали, всего в шесть точек (3 – одной серии сывороток и 3 – другой). Кроме того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной сыворотки группы AB(IV), не содержащей резус-антител (контроль на неспецифическую агглютинацию).

К первой капле каждой серии сыворотки добавляют 1 каплю (0,05 мл) взве­си исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой серии – 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных эритроцитов, одноименных с группой крови больного или группы 0(I), и к третьей капле каждой серии –1 каплю (0,05 мл) контрольных ре­зус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой крови боль­ного по системе АВ0. В контрольную каплю с сывороткой группы AB(IV), не со­держащей резус-антител, добавляют 1 каплю (0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной палочкой и пластину опускают в водяную баню при +46 – +48°С на 10 минут.

Трактовка результатов

Результаты исследований просматривают при легком покачивании пластины, чашки Петри и оценивают по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.

При положительном результате агглютинаты легко различимы на почти обес­цвеченном фоне жидкости.

При отрицательном результате капля остается равномерно окрашенной в красный цвет.

Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являют­ся резус-отрицательными (rh-). Однако эти результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы 0(I), а также при отрицательном результате в контрольной капле с сыво­роткой группы AB(IV), не содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истин­ный. В этих случаях резус-принадлежность следует определять, применяя другие методы исследования.

4. Определение резус-принадлежности эритроцитов реакцией

агглютинации в солевой среде

Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов,

изделий медицинской техники

Стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;

стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;

пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций;

лупа с 2-4-кратным увеличением;

термостат на +37°С.

Предварительная обработка исследуемой крови и

стандартных эритро­цитов

Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки, со­держащие 0,25 мл (5 капель) раствора лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCI, содержимое их переме­шивают и центрифугируют.

Кровь можно брать без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сгусток для отде­ления большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как указано выше.

Из отмытых эритроцитов приготавливают 2%-ую взвесь, для чего 1 каплю эри­троцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCI. 2%-ую взвесь эритроцитов используют для исследования.

Допустимо хранить кровь в течение 2 суток при +4 – +8°С.

Техника определения

В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и две – для контролей. Предварительно штатив на­крывают листом бумаги. На нем слегка накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться. Во все пробирки (лунки планшета) первого ряда вводят по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) второго ряда – по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле изотонического раствора NaCI.

В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета) добавляют по 1 капле (0,05 мл) 2%-ой взвеси испытуемых эритроцитов, а в контрольные – по 1 капле (0,05 мл) 2%-ой взвеси контрольных стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термо­стат при +37°С на 1 час. Можно затем оставить пробирки при комнат­ной температуре еще на 1,5-2 часа до учета результата.

За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.

Трактовка результатов

Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси над источником света, закрытым матовым стеклом.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.

При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне не­равномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его струк­туры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части. При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномер­ным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с небольшим просветлени­ем в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.

Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше, чем при поло­жительном.

Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).

Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными.

Примечание: полные антитела не выявляют слабый антиген D^u.

Дата добавления: 2015-11-28 | Просмотры: 1017 | Нарушение авторских прав