 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
IX. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно сделать при положительном результате, полученном любым методом исследования. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно сделать только при отрицательном результате, полученном при исследовании не менее, чем двумя методами, одним из которых является любой метод, выявляющий неполные резус-антитела, а другим – реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра ____________Р.А. Часнойть 13.11.2008 г. Регистрационный № 116-1108
УДАЛЕНИЕ ИЗ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС АНТИТЕЛ ДРУГОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ
инструкция по применению
УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»
АВТОРЫ: д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л., Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.
Минск, 2008
В практической работе по определению резус-принадлежности крови наибольшее удобство представляет использование сывороток антирезус группы крови AB(IV), не содержащих групповых агглютининов a и b (антитела анти-А, анти-В). Такие сыворотки являются универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность в крови любой группы по системе АВ0. Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам 0(I), А(II) и В(III), также могут быть превращены в универсальные путем абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов a и b. Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные антитела другой специфичности, чаще всего анти-С и анти-Е. Если эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи абсорбции или путем разведения сыворотки. Использование универсальных сывороток антирезус упрощает работу и исключает получение ошибочных результатов из-за несоответствия сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов по другим групповым антигенам. Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов a, bи от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы: нейтрализацию групповых агглютининов a и bсоответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической жидкости; нейтрализацию групповых агглютининов a и bестественным групповым веществом А и В (фруглюмин А, фруглюмин В); абсорбцию групповых агглютининов a и bрезус-отрицательными эритроцитами, находящимися в сгустках крови после снятия с них сыворотки; нейтрализацию групповых агглютининов a и bпутем разведения сыворотки; абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой специфичности; нейтрализацию антител анти-С и анти Е путем разведения сыворотки.
1. Использование амниотической жидкости для нейтрализации групповых агглютининов a и b*
Получение амниотической жидкости для использования ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть получено от 100 до 1500 мл. ____________________________________________________________________ * Амниотическая жидкость нейтрализует a и b антитела, относящиеся к классу IgM; неполные a и b антитела, относящиеся к классу IgG, при этом не нейтрализуются. Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден для работы. На этикетке флакона указывают фамилию роженицы, дату взятия, количество и, по возможности, группу крови новорожденного. Дополнительно берут образец крови для обследования на маркеры вирусных инфекций. Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует группе крови новорожденного. Оплата за сбор амниотической жидкости производится учреждениями службы крови из средств на заготовку крови на договорной основе. Нейтрализация групповых агглютининов a и b при помощи амниотической жидкости
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают путем определения групповой принадлежности крови новорожденного или методом истощения агглютининов a и b в гемагглютинирующей сыворотке группы 0(I). Для этого в пробирке смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей сыворотки с титром 1:64 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III). Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно 1:10, экспозиция 5-7 минут. Трактовка результатов: наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А (II) и группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости групповых антигенов А и В, т. е. на принадлежность ее к группе 0(I). Такая амниотическая жидкость непригодна для нейтрализации групповых агглютининов; отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II) и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В (III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II); отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе В(III); отсутствие агглютинации в каплях, как с эритроцитами группы А(II), так и группы В(III), указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе AB(IV). Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую наклеивают на флакон с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых агглютининов. Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой принадлежности крови.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера, в которую помещает измельченную фильтровальную бумагу толщиной 5-7 мм. После фильтрации амниотическая жидкость становится прозрачной. Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 г на 100 мл или азидом натрия - 1 г на 1000 мл. Срок хранения амниотической жидкости - 12 месяцев при +4 – +8°С. Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость высушивают по 150-250 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической жидкости по системе АВ0, ее исходного количества и даты высушивания. Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной температуре. Срок годности – 5 лет.
Проведение нейтрализации групповых агглютининов Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная и затем растворенная дистиллированной водой. Для нейтрализации агглютининов a и b в сыворотке антирезус группы 0ab(I) используют амниотическую жидкость группы AB(IV) или смесь образцов амниотической жидкости групп А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов b в сыворотке группы Аb(II) используют амниотическую жидкость группы В(III). Для нейтрализации агглютининов a в сыворотке антирезус группы Вa (III) используют амниотическую жидкость группы А(II). Для полного истощения групповых агглютининов в исходной сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для чего: в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, во все пробирки вносят по 2 капли амниотической жидкости – нативной или растворенной после высушивания; в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой сыворотки, во вторую - 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую - 10 капель, в пятую -12 капель; содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре; после 10-ти минутной экспозиции смесь из каждой пробирки контролируют на плоскости по полноте нейтрализации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам; последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация (время наблюдения 5 минут), принимается за оптимальное соотношение амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки; если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят разведения: 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано выше; после того, как выбрано оптимальное соотношение, к основному объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 минут после перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III). Далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с инструкцией по применению «Использование стандартных сывороток и универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека». В целях упрощения получения универсальных сывороток из сывороток антирезус группы Аb(II) и Вa(III) их можно предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать одновременно агглютинины a и b амниотической жидкостью группы AB(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом происходит частичная взаимная нейтрализация групповых агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости, необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается степень разведения абсорбируемой сыворотки. Высушенную амниотическую жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до исходного объема. После растворения используют аналогично нативной. При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают с определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего: в штатив устанавливают 4 пронумерованные пробирки, в которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус; в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической жидкости, во вторую – 4 мг, в третью – 8 мг, а в четвертую – 16 мг. Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и оставляют при комнатной температуре; через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают оптимальное соотношение ингредиентов; выбранное соотношение используют для изготовления основного объема сыворотки; Далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с инструкцией по применению «Использование стандартных сывороток и универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека».
2. Нейтрализация групповых агглютининов a и bестественными групповыми веществами специфичности А и В (фруглюмином А и В)
Групповые специфические вещества А и В являются высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных желудков путем их ферментативного переваривания с последующим осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус добавляют групповое специфическое вещество из расчета: к 1000 мл сыворотки антирезус группы 0(I) - 0,1 г группового вещества А и 0,1 г группового вещества В; к 1000 мл сыворотки антирезус группы A(II) - 0,1 г группового вещества В; к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III) - 0,1 г группового вещества А. Для растворения группового вещества необходимое его количество сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус, подогретой до +37°С. Затем это групповое вещество переносят в общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая его сывороткой. Сыворотку антирезус перемешивают с групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая каждые 30 минут. После этого сыворотку помещают в холодильник при +4°С не менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III). Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и вся процедура повторяется. При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку исследуют и обрабатывают далее в соответствии с инструкцией по применению «Приготовление и использование стандартных сывороток и универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека».
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными эритроцитами на свертках крови группы AB(IV)
Неотмытые сгустки крови группы AB(IV), оставшиеся после отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при +4 – +8°С в течение 1-2 суток. Для абсорбции охлажденный сгусток измельчают при помощи стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему, занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают 50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности групповых антител). Сыворотку тщательно смешивают со сгустком, оставляют на 18-20 часов при +4 – +8°С, после чего отделяют от сгустка путем центрифугирования. Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов и, в случае полной абсорбции групповых агглютининов, обрабатывают и исследуют далее в соответствии с инструкцией «Приготовление и использование стандартных сывороток и реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека».
4. Нейтрализация групповых агглютининов a и b при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCI, специально подобранной сывороткой группы AB(IV) или стандартным раствором для разведения. Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна только лишь при большом различии титра групповых и резус-антител. Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует развести не менее, чем в 16 раз, что возможно только в том случае, если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус. В процессе работы в начале следует приготовить пробные разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III). При сохранении достаточного титра резус-антител и полноте абсорбции сыворотку обрабатывают и исследуют в соответствии с инструкцией «Приготовление и использование стандартных сывороток и реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека».
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антител анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус, последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения сыворотки. Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции применяются эритроциты фенотипа Ccddee, а если имеется примесь анти-Е, то эритроциты фенотипа ccddEe. Абсорбция проводится в течение 2-3 часов при температуре +37°С при помешивании, с последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность. Если сопутствующие антитела не удалились, абсорбцию можно повторить. Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже, чем 1:128-1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2. Сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCI, сывороткой для разведения или стандартным раствором для разведения. В начале следует делать пробные порции, которые исследуют на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность достаточного титра резус-антител-анти-D. При положительном результате разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции, так и после разведения основного объема сыворотки, ее вновь обрабатывают и исследуют далее в соответствии с инструкцией по применению «Приготовление и использование стандартных сывороток и универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека». Примечание: при использовании моноклональных антител к эритроцитарным антигенам системы Резус проведение дополнительной абсорбции стандартных сывороток не требуется.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра ____________Р.А. Часнойть 13.11.2008г. Регистрационный № 117-1108
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ПОСТТРАНСФУЗИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ АНТИГЕНАМИ СИСТЕМЫ КЕLL
инструкция по применению
УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»
АВТОРЫ: д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л., Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.
Минск, 2008 Наиболее выраженными антигенными свойствами среди минорных антигенов эритроцитов обладают факторы Kell (K). Фактор К стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Фактор К встречается примерно у 10% людей, поэтому почти каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной крови К- отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность - это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом. Чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору К, необходимо выдавать в лечебные учреждения эритроциты, тестированные по Кеll. В отделениях и станциях переливания крови следует производить определение К-фактора у всех доноров в обязательном порядке наряду с определением групповой- и резус-принадлежности крови, после чего отбирать К-положительные образцы, не допуская их переливания K-отрицательным детям и женщинам детородного возраста. К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид донорства (плазмы, тромбоцитов), но не эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить индекс сенсибилизации населения к фактору К, что, в свою очередь, будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической болезни новорожденных. Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью следующих методов: 1. Непрямая проба Кумбса. 2. Желатиновый метод в пробирках. 3. Экспресс-метод на плоскости. Методика проведения исследования каждым из вышеуказанных методов указана в прилагаемой инструкции к реагентам.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра ____________Р.А. Часнойть 13.11.2008 г. Регистрационный № 118-1108
ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУННЫХ АНТИ-А, АНТИ-В АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ЭРИТРОЦИТОВ СИСТЕМЫ АВ0
инструкция по применению
УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»
АВТОРЫ: д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л., Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.
Минск, 2008 Антитела к эритроцитарным антигенам системы АВ0 – a и b–являются нормальными (естественными). Они относятся к полным антителам – агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнатной температуре и хуже – при температуре +37°С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют. Нормальные антитела a и bлегко абсорбируются из сыворотки при добавлении группоспецифических веществ. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при +70°С в течение 10 минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность. Кроме нормальных (естественных) антител a и b,у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые были обозначены символами анти-А и анти-В. Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногруппной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВ0, а также при проведении некоторых прививок и иммунизации. При иногруппной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител a и b. При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на 5-7 день, достигая максимума к 15-25 дню с последующим падением их титра. В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител a и bна 3-8 ступеней, также с последующим снижением после 25-30 дня. Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной, так и неполной форме. Они активны при +37оС, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде, по сравнению с солевой, и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении группоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре +70оС, т.е. при условиях, при которых нормальные антитела a и bполностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител a и bот иммунных антител анти-А и анти-В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител a и bи изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде способности вызывать агглютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса. Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность.
I. Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов, изделий медицинской техники
Для определения антител a, bи иммунных антител анти-А, анти-В требуются: стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы; стандартная сыворотка для пробы Кумбса; изотонический раствор NaCI; пробирки центрифужные; пробирки маленькие высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 5-6 мм и с гладким дном округлой формы; пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса; белые пластинки со смачиваемой поверхностью; штативы; термостат +37оС; центрифуга; водяная баня +70оС.
II. Определение полных иммунных антител к эритроцитарным антигенам системы АВ0 в реакции солевой агглютинации
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCI путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3%-ую взвесь отдельно каждой группы. Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NaCI во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при +70°С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получается две порции сыворотки – нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4. Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы 0(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки – степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000)*. Во все пробирки каждого ряда, начиная со 2-ой пробирки, накапывают по 2 капли изотонического раствора NaCI. Затем в 1-ую и во 2-ую пробирки (каждого ряда) накапывают по 2 капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в 4 раза. Во 2-ой пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NaCI и 2 капли этой смеси переносят в 3-ю пробирку, из 3-й, также после перемешивания – в 4-ую и т. д. до последней, из которой 2 капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000. В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по 6 пробирок – разведение сыворотки от 1:4 до 1:128). После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по 1 капле 2-3%-ой взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) - эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы A(II) - эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы 0(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой ряд - эритроциты группы В(III). Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой – при комнатной температуре, с прогретой - при +370C.
________________________________________________________________ *Вместо пробирок можно использовать планшеты для иммунологических реакций с круглодонными лунками 3. Трактовка результатов
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6-8 кратным увеличением над источником света. При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-). Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а максимальное разведение, в котором оно наблюдается, - об их титре. Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам a или b,титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А или анти-В. В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки. Отрицательный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
III. Определение неполных изоиммунных антител к эритроцтарным антигенам системы АВ0 в непрямой пробе Кумбса
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCI, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В (III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы 0(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и другие сведения, как сказано выше для реакции солевой агглютинации. Во все пробирки, начиная с пробирки №2, накапывают по 3 капли изотонического раствора NaCI, а затем в пробирки №1 и №2 - по 3 капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель. Во все пробирки пастеровской пипеткой или наконечником автоматической пипетки добавляют по 1 капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами, и штатив помещают для инкубации в термостат на 45 минут при +37°С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах. После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NaCI, перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза. После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель изотонического раствора NaCI для получения приблизительно 5%-ой взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по 1 капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки. Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в минутах и секундах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-). Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а максимальное разведение, в котором оно наблюдается - об их титре*. Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки. В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
3. Трактовка результатов
В ходе вышеописанного исследования определяют три вида антител: нормальные полные антитела – агглютинины a и b(термолабильные); иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные); иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные). _______________________________________________________________ *Контроль в отношении возможного ложно-положительного результата за счет активных полных антител не требуется, т.к. в данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только при отрицательном результате реакции в солевой среде. Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований: наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместимого по АВ0 системе. Титр полных (термолабильных) антител a и bредко превышает такие показатели, как 1:8 – для иммунных полных антител и 1:32 – для иммунных неполных антител; высокий титр нормальных полных антител – агглютининов a и b(a выше, чем 1:256 и b выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВ0; отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител a не выше, чем 1:256 и b не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВ0 к моменту данного исследования.
ІV. Выявление иммунных (IgG) анти-А, анти-В антител с использованием унитиола
1. Характеристика метода
Выявление IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВ0 затруднено из-за одновременного присутствия в сыворотке естественных изогемагглютининов, относящихся к классу IgМ. В данном методе иммунные IgG анти-А, анти-В антитела выявляются после полного разрушения унитиолом естественных IgМ антител системы антигенов эритроцитов АВ0. Для инактивации IgМ используют сульфидредуцент, разрушающий дисульфидные связи в молекулах иммуноглобулинов, 5%-ый раствор унитиола (2,3-димеркаптопропансульфонат Nа). Выявление IgG анти-А, Метод пригоден для дифференциальной диагностики IgG и IgМ антител к антигенам эритроцитов любой специфичности в сыворотке крови человека, молоке, а также моноклональных антителах.
2. Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов, изделий медицинской техники
5%-ый раствор унитиола; моноклональные антитела анти-D супер IgМ; стандартные эритроциты групп крови А, В, а также эритроциты раствор NaCI 0,9%-ый; термостат лабораторный на +37°С; планшеты с белой смачиваемой поверхностью; пробирки вместимостью 5-10 мл; пипетки; штативы; палочки аппликаторы; часы (секундомер); перчатки резиновые хирургические.
3. Порядок проведения исследования
Для приготовления рабочего раствора 2,5%-го унитиола используют 5%-ый раствор унитиола (готовая лекарственная форма), который разводят раствором NaCI 0,9%-ый в соотношении 1:1. В сухой чистой пробирке смешать равные объемы исследуемой сыворотки и 2,5%-го раствора унитиола – опыт. Во второй пробирке смешать равные объемы моноклональных антител анти-D супер IgМ и 2,5%-го раствора унитиола – контроль. Все пробирки инкубировать 24 часа при комнатной температуре (не ниже +16°С) или в термостате при +37°С в течение 2 часов. При использовании для разрушения IgМ антител 5%-го раствора унитиола инкубацию сывороток в термостате сокращают до 1 часа. Сыворотки после обработки раствором унитиола исследуют в тесте прямой агглютинации с эритроцитами А и/или В в условиях, аналогичных исследованию естественных изогемаггютининов на плоскости без подогрева или в пробирках с использованием центрифугирования. Для контроля используют эритроциты группы крови 0(I) резус-положительной принадлежности.
4. Трактовка результатов
Сыворотки, инкубированные с раствором унитиола и сохранившие способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В, содержат анти-А или анти-В антитела класса IgG – положительный результат. Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце IgG антител к антигенам эритроцитов, при этом сыворотки утрачивают способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В. Результат в контрольной пробе должен быть всегда отрицательным, что свидетельствует о разрушении антител класса IgМ в моноклональных антителах анти-D и эффективности действия унитиола. Для установления титра IgG антител производят последовательное разведение сывороток, бывших в контакте с унитиолом. За титр принимают величину, обратную наибольшему разведению, в котором отчетливо видна агглютинация со стандартными эритроцитами групп А и/или В. Время наблюдения за реакцией – 5 минут при проведении исследования на плоскости без подогрева.
5. Условия хранения и эксплуатации
Срок хранения вскрытой ампулы 5%-го раствора унитиола не должен превышать 5 дней при хранении в холодильнике (t +2°– +8°С).
V. Определение гемолизинов системы АВ0
1. Перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов, изделий медицинской техники
стандартные эритроциты группы 0(I), А (II) и В(III); изотонический раствор NaCI; пробирки вместимостью 8-10 мл; маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см; штативы; термостат +370С; центрифуга.
2. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты групп 0(I), А(II) и B(III), а также эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоническим раствором NaCI путем центрифугирования и готовят из них 5%-ую взвесь в изотоническом растворе NaCI. Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не более 48 часов при температуре +4 – +8OС. В предварительно пронумерованных 5 пробирках вместимостью 8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом растворе NaCI, начиная от 1:2 до 1:32, в объемах 2-3 мл.
3. Техника реакции
В штатив устанавливают по 5 маленьких пробирок: три ряда при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда - при исследовании сыворотки группы 0(I). Пробирки нумеруют одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с исходными разведениями сыворотки. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 – 1:32). Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по 5 капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т. д. до 1:32. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5%-ой взвеси эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты лица, сыворотка которого исследуется; во второй (также контрольный) ряд - эритроциты группы 0(I); в третий ряд вводят эритроциты противоположной группы, т. е. группы В(III), если исследуется сыворотка группы А(II) или группы А(II), если исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки группы 0(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в четвертый ряд – эритроциты группы В(III). Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и штатив помещают в термостат на 45 минут при температуре +37°С, затем пробирки вынимают из термостата и просматривают результат реакции невооруженным глазом в проходящем свете.
4. Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие групповых гемолизинов анти-А и анти-В. Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности окрашивания надосадочной жидкости: если эритроциты полностью сохранились в осадке, а надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, что групповые гемолизины отсутствуют (обозначают знаком минус (-); если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочная жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности (иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от одного плюса (+) до трех плюсов (+++); если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на четыре плюса (++++); наличие гемолиза эритроцитов свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке гемолизинов, а максимальное разведение, в котором он наблюдается - об их активности (титре). В том случае, если гемолиз эритроцитов произошел во всех пробирках, исследование следует повторить, продолжив разведение сыворотки, для установления конечного разведения, в котором еще наблюдается гемолиз. Результаты учитывают как истинные, т.е. относящиеся к гемолизинам анти-А и анти-В, только при отсутствии гемолиза в двух контрольных рядах. При наличии гемолиза не только с эритроцитами противоположной группы, но и в контрольных рядах – исследование повторяют. При подтверждении результатов реакции следует решать вопрос о природе обнаруженных гемолизинов с учетом характера заболевания и других показателей.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра ____________Р.А. Часнойть 13.11.2008 г. Регистрационный № 119-1108
ИММУНИЗАЦИЯ ДОНОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ И ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРЕЗУС
инструкция по применению
УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»
АВТОРЫ: д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л., Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.
Минск, 2008 1. Отбор доноров для иммунизации
К иммунизации эритроцитами с антигенами системы Резус могут привлекаться доноры-мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или моложе, если у них уже наступила менопауза. Реиммунизация может производиться лицам, ранее сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных беременностей или переливания им крови. Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц и с их письменного согласия. Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и сенсибилизированные лица, привлеченные к донорству, проходят медицинский осмотр согласно «Инструкции о порядке медицинского осмотра доноров и взятия у них крови и ее компонентов», утвержденной Министерством здравоохранения Республики Беларусь 28.04.2006 г. Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщин выкидышей, мертворождений, гемолитической болезни у их новорожденных и другой патологии, связанной с резус-конфликтом, не является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее 120 г/л, количества эритроцитов — не менее З,7х1012/л, лейкоцитов – до 10х109/л. У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию, проводят исследования на маркеры вирусов гепатитов В и С, иммунодефицита человека (ВИЧ), сифилиса, на содержание аланинаминотрансферазы. Эти исследования повторяют перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации. К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови маркеров вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), сифилиса, у которых уровень аланинаминотрансферазы находится в пределах нормы. Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь которых будет использована в качестве антигена, типируют по антигенам системы резус: D, С, Е, с, е и, по возможности, других систем (Келл, Даффи и т. д.). До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие различных форм резус-антител, а эритроциты — прямой пробой Кумбса. Положительный результат прямой пробы Кумбса является противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же, как и вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител устанавливают их специфичность и титр. Если полученные показатели не дают возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител такому лицу можно проводить реиммунизацию. После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае необходимости гемотрансфузии. Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге, отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный влагоустойчивый конверт. В справке должныбыть указаны: город иназваниеучреждения, производившего иммунизацию и выдавшего справку; фамилия, имя, отчество донора; группа крови по системе АВ0; резус-принадлежность (фенотип); чем иммунизировали (резус-антиген); указание врачу, переливающему кровь:«При необходимости гемотрансфузии обязателен индивидуальный подбор совместимой крови только от резус..........лиц». Справка должна быть подписана руководителем учреждения с указанием даты и скреплена печатью.
2. Выбор крови, используемой в качестве антигена
Антигеном для иммунизации служат эритроциты консервированной крови активных доноров группы 0(I) или одноименной с кровью иммунизируемого лица. Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров, дающих кровь для переливания больным, кровь донора антигена должна быть обследована на содержание аланинаминотрансферазы и билирубина (количественные реакции). Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью. Рекомендуется использовать для иммунизации эритроциты одного и того же донора. Для иммунизации могут быть использованы только криоконсервированные размороженные эритроциты со сроком хранения не менее 6 месяцев (при наличии повторного тестирования крови донора через 4 месяца). Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с антисывороткой соответствующей специфичности. При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и того же донора.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в специально отведенном помещении, в котором не производится работа с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков. Для иммунизации при внутримышечном введении антигена применяют шприцы одноразового пользования, для внутривенного введения применяют одноразовые пластиковые устройства. Перед началом и на 15-30 день после окончания каждого курса иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на наличие, специфичность и активность антител. Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров антигенами системы Резус. Однако при необходимости в этих схемах могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев между курсами, и в дозах - в пределах ±5 мл. При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь, используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц, имеющих фенотип эритроцитов ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа ccDee. Однако в процессе такой иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела анти-С. Во избежание этого можно привлекать к иммунизации лиц фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа ССDee.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови (отмытых эритроцитов) донора антигена в количестве: первая - 10 мл крови, последующие инъекции - по 5 мл с интервалами между ними три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс иммунизации. Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора антигена по 5 мл на каждую с интервалами три-четыре дня. Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные второму курсу. Если после четвертого курса у донора не выработается антител, через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами, следует провести сокращенные курсы по типу реиммунизации. Если и после такой длительной иммунизации антитела не образуются, донора от иммунизации отстраняют. После выработки у донора активных антител, для сохранения и дальнейшего повышения их титра, им необходимо периодически проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизация доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались резус- антитела анти-D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает возможность сохранить титр антител в крови иммунизированных лиц или добиться его повышения. Подбор эритроцитов крови – антигена для реиммунизации –проводится так же, как и для иммунизации. Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания иммунизации и появления антител и затем повторяется при снижении титра антител ниже 1:64. У лиц, иммунизированных в результате беременностей или трансфузий крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре месяца, но только вне периода беременности и лактации. Реиммунизация состоит из двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения 3-5 мл эритроцитов донора (антигена) за одну-две недели до кроводачи.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от четырех месяцев до года и более от начала иммунизации. Титр антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры анти-D антител у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются не ранее, чем через полтора года. Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее, чем у 70% иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е*
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие сочетания фенотипов крови иммунизируемого лица и эритроцитов, применяемых для иммунизации:
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются две схемы иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови донора антигена с перерывом по 2 дня. Первые пять инъекций – по 2 мл и последующие пять – по 1 мл. Затем следует перерыв в 4 месяца. Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных введений крови с интервалами по 2 дня. Первые пять инъекций – по 1 мл и последующие пять – по 0,5 мл. Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через 4 месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяют каждые 4 месяца.
___________________________________________________________________________________________________ *Иммунизация проводится только по согласованию со специалистами ГУ «РНПЦГТ»
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови с интервалами по 2-3 дня. Первая инъекция - 10 мл и последующие пять - по 5 мл. Через 8-10 месяцев проводится второй курс. Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови по 5 мл с интервалами по 3-4 дня. Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через 4 месяца проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму и так повторяется каждые 4 месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев (полные) до 3 лет (неполные) после начала иммунизации. Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром от 1:2 до 1:8 для неполных антител и от 1:2 до 1:32 – для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного влияния на состояние здоровья доноров. В процессе иммунизации, а также после выработки антител при взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться преходящие изменения периферической крови, например, увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов – до 12%, лимфоцитов – до 50%, повышение содержания общего количества лейкоцитов до 10х109//л, общего билирубина до – 20,5 мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы – до 1,36 мкмолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за один час инкубации при +37°C. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы (плазмаферез). Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц, обработка сывороток и их испытание производятся согласно действующей инструкции «Приготовление и использование стандартных сывороток и универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности крови человека». Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию и сдачу крови и плазмы (плазмаферез) производится согласно действующим нормативным документам Совета Министров Республики Беларусь.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра ____________ Р.А. Часнойть 13.11.2008 г. Регистрационный № 120-1108
ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РЕДКИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОАНТИГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА
инструкция по применению
УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»
АВТОРЫ: д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л., Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.
Минск, 2008 Под редкими группами крови понимают такие сочетания групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а) отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты встречаемости; б) отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе активных и высокой частоты; в) содержатся различные редкие антигены; г) имеются редкие сочетания антигенов разных систем. Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей, чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела, редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является редкость или, наоборот, высокая частота антигенов, против которых могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная активность некоторых антигенов. К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки, содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы Резус–С, Е, с, е, Сw или к одному из антигенов других систем – Келл, Даффи, Кидд, Левис, Лютеран, MNSs и др. К редким сывороткам относятся также полиспецифические сыворотки, содержащие два или более вида антител, одними из которых чаще всего бывают антитела анти-D, а другими – антитела редкой специфичности. К таким редким полиспецифическим сывороткам относят сыворотки анти-C+D, анти-D+E, анти-C+D+E, анти-D+анти-Fyа, анти-D+Келл и другие сочетания антител анти-D с какими-либо редкими антителами, а также все сочетания только редких антител, например, анти-С+е, анти-С+анти-Fyа и т.д. Трансфузионная терапия, проводимая лицам c редкими группами эритроцитарных антигенов, повышает возможность образования редких антител, особенно, если кровь переливалась повторно и у реципиента были в прошлом беременности. Реиммунизация соответствующим антигеном проводимая лицам, иммунизированным естественным путем при беременности или вследствие трансфузий крови, еще более повышает возможность образования активных редких антител. Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном. Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток антирезус (инструкция по применению «Иммунизации доноров для получения стандартных сывороток и иммуноглобулина антирезус»). Реиммунизация допустима для повышения активности любых антител, так как не вносит ничего качественно нового в иммунологический статус иммунизируемого лица и, следовательно, не создает дополнительной опасности в случае необходимости переливания крови. Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток является искусственная иммунизация доноров-добровольцев. Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в виде неблагополучных исходов последующих беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Дата добавления: 2015-11-28 | Просмотры: 712 | Нарушение авторских прав |