АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Основное назначение редких сывороток в организациях

Службы крови

Моноспецифические сыворотки антирезус анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е, ан­ти-С^w, а также моноспецифические сыворотки других систем применяются наряду с сыворотками анти-D при фенотипировании крови доноров для создания панели стандартных эритроцитов и кадров типированных доноров, в том числе доноров редких групп, а также для установления фенотипа крови больных и других лиц с целью выяснения причин и предупреждения сенсибилизации и посттрансфузионных осложнений.

Полиспецифические сыворотки анти-C+D, анти-D+E, анти-C+D+E применяют­ся при обследовании доноров и при обработке их крови на втором этапе исследо­вания на резус-принадлежность. При этом сыворотки анти-C+D и анти-D+E долж­ны быть использованы одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-C+D+E.

Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела других систем, например, анти-Fу^a или анти-Келл, являющиеся, главным образом, случайными находками, могут быть использованы при исследовании крови резус-отрицательных лиц для определения у них антигенов, против которых направлены дополнительные антитела.

2. Источники и способы получения сыворотки

Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е необходи­мо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем, и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией. Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров-добро­вольцев, которая требует длительных курсов, так как не всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток анти-С.

Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать только от лиц, сенсибилизированных естественным путем. Рекомендуется привлечение та­ких лиц к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать резус-положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и, в большинстве случаев, – резус-положительная кровь.

Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд, анти-S, анти-s, анти-С^wследует получать от лиц, сенсибилизированных естествен­ным путем. Поскольку такие антитела возникают исключительно редко, чаще всего при беременности в сочетании с многократными трансфузиями крови, то выявле­ние таких сенсибилизированных лиц, то есть первичный поиск редких антител, следует организовать с привлечением к этой работе отделений переливания кро­ви при больницах.

В последующем этих лиц желательно привлекать к донорству с после­дующей реиммунизацией.

Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров, поскольку такие ан­титела иногда (очень редко) бывают у людей врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц, сенсибилизированных естественным путем - беременностями и трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими антигенами противопоказана.

Сыворотки двойной специфичности анти-С+Dследует получать от лиц, сенсибилизированных естественным путем, с последующим привлечением их к донорству и реиммунизации.

Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+E и анти-C+D+E – могут быть получены почти исключительно путем искусственной иммунизации до­норов-добровольцев, так как такое сочетание антител очень редко возникает при естественной сенсибилизации.

Антитела специфичности анти-C+D, анти-D+E и анти-C+D+E иногда обра­зуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с использованием тех антиге­нов, против которых требуется повысить титр антител.

Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой специ­фичности могут быть получены от лиц, сенсибилизированных естественным путем при беременности и трансфузиях крови, и только на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких сенсибилизированных лиц быстро ослабе­вают или исчезают из крови. Искусственная иммунизация для получения таких сывороток противопоказана.

3. Методы иммунизации и реиммунизации

Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и анти-Е следует производить согласно инструкции "Иммунизация доноров для по­лучения стандартной сыворотки и иммуноглобулина антирезус".

Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е с использованием эри­троцитов соответствующего фенотипа. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.

Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами S, s, С^w следует производить аналогично иммунизации антигенами С и Е. Возможны неко­торые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов. Иммунизацию и реим­мунизацию для получения сывороток анти-C+D, анти-D+E и анти-C+D+E следует производить на фоне уже имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена ана­логичны дозам при иммунизации антигенами С и Е. Длительность курса зависит от срока появления антител.

Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка по фор­ме, предусмотренной действующей инструкцией по применению "Иммунизация доноров для получения стандартной сыворотки и иммуноглобулина антирезус" с указанием антигена, кото­рым проводилась иммунизация. Иммунизация животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р, анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и лабораторным регламентам применения этих сывороток.

4. Методы и дозы взятия крови

У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для последующего по­лучения сыворотки или плазмы методом плазмафереза.

Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких лиц и пред­усмотрены действующей «Инструкцией о порядке медицинского осмотра доноров крови, взятия у них крови и ее компонентов".

5. Показатели пригодности редких сывороток для практического

использования

Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать. Допустим красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание вследствие присутствия желчных пигментов. Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для практического ис­пользования при титре полных или неполных антител не ниже 1:16. Ввиду ред­кости и трудности получения таких сывороток, при хорошей авидности специфических антител допускает­ся использование их с титром 1:8.

Сыворотки анти-C+D, анти-D+E и анти-C+D+E должны иметь титры антител анти-D не ниже: полных — 1:16, неполных — 1:32. Титр антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не ниже 1:16.

Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела к антиге­нам других систем, годны для использования специалистами сероло­гических лабораторий организаций переливания крови при любом титре антител от 1:8 при хорошей их авидности. Выдача комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворот­ке, содержащей редкие антитела одной специфичности, одновременно содержат­ся другие антитела с низким титром и слабой авидностью, то сыворотка нуждает­ся в абсорбции или может быть использована специалистами на станциях переливания крови. Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не подлежит.

6. Организация поиска и первичное исследование редких сывороток

Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения сывороток редкой специфичности следует организовать работу по выявлению сенсибилизи­рованных лиц как среди резус-отрицательных, так среди резус-положительных больных и доноров с привлечением к этой работе лабораторий, в которых прово­дятся определения резус-принадлежности эритроцитов крови.

Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на сенсибилизацию производится в организациях переливания крови, включая отделения переливания кро­ви при больницах. Первичное исследование сывороток лиц, подвергающихся ис­кусственной иммунизации, производится на станциях переливания крови, произ­водящих иммунизацию.

Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или реакцией конглютинации с применением желатина для выявления неполных антител и реак­цией агглютинации в солевой среде для выявления полных антител.

С целью сокращения объема работы при первичном исследовании сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно большего числа анти­генов в одном образце; удобнее всего фенотип CcDEe, K+, Fу^а+, Jk+.

В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления антител следу­ет приготовить смеси эритроцитов группы 0(I) по 5-6 образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов, считая каждую смесь за один образец.

Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из осадка кро­ви, взятой из вены со стабилизатором или из места укола пальца.

При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител можно проводить одновременно с определением резус-принадлеж-ности, подвергая испытанию сыворотку каждого исследуемого лица. При этом допустимо предвари­тельно исследовать сыворотку методом конглютинации с желатином с помощью одного "стандарта" эритроцитов. В качестве такого стандарта следует использо­вать смесь 2-3 образцов резус-положительных эритроцитов группы 0(I), содержа­щих антигены D, С, Е, с, е, С^W, Келл, Fy и другие.

Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется далее в лабораториях станций переливания крови, где устанавливается специ­фичность, активность и форма антител.

Исследование сывороток начинается с проверки групповой принадлежности по системе АВ0. Затем сыворотка исследуется на специфичность, активность и форму антител. Для исследования применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде. Следует иметь в виду, что в одной и той же сыворотке могут содержаться как пол­ные, так и неполные антитела, причем их специфичность может совпадать или быть различной. Так, например, сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и анти-Е и в то же время – полные антитела анти-С и анти-Е или только полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть раз­личен.

Широта исследований зависит от возможности станции переливания крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в ГУ «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии» (ГУ «РНПЦГТ»).

Для полного выявления антител, установления их специфичности, формы и титра следует использовать панель типированных стандартных эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать эритроциты группы 0(I).

В качестве образцов в панель можно включать эритроциты типированных до­норов, для чего берут у них кровь из вены в пробирку с изотоническим раствором цитрата нат­рия или консервантом. Эритроциты перед употреблением отмывают двукратно изо­тоническим раствором хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3 дня, после отмывания - 1 день.

Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с консервантом, применяемым для консервирования крови, она может храниться 1 месяц при температуре +4 – +8°С. Перед использованием эритроциты двукратно отмывают изотоническим рас­твором хлорида натрия. Срок годности отмытых эритроцитов - 1 день.

Более эффективно применение эритроцитов доноров редких групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах - 2-5 мл. Размороженные эритроциты отмывают специальными растворами, используемыми для эритроцитов, предназначенных для трансфузии. После отмывания эритроциты используются в тот же день.

В панели должны быть представлены стандартные эритроциты, позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах следующих систем Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, MNSs, Лютеран, Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть расширена за счет увеличения образцов или уменьшена, но так, чтобы в нее по возможности были включены как положительные, так и отрицательные образцы для каждого антигена.

Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных должны быть эритроциты, содержащие пять анти­генов системы Резус – CcDEe. В этих же образцах имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем. Таким образом, положительная реакция с этими образцами укажет на наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их специфичности.

Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам ССDЕе, CcDEE, CcDee, CCDee, ccDEe и ccDEE. Часть их гомозиготна, а часть – гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для идентификации антител анти-с и анти-е.

Затем следуют образцы фенотипов ccDee, Ccdde, CCddee и ccdEe. Эти образцы да­ют возможность выявлять специфичность антител в системе резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием антигена С (фенотип CCdee). Этот образец дает возможность идентифицировать антитела в очень редких сыво­ротках, например, анти-D + анти-с.

Среди резус-положительных образцов в панели должны быть разновидности с содержанием антигена D^u и антигена С^w. Образец D^u служит для того, чтобы уста­новить, достаточно ли активны антитела анти-D. Образец с содержанием антигена С^w служит для выявления антител анти-С^w.

Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная реакция с ко­торыми указывает на наличие антител по другим системам. Эти образцы содержат разнообразные сочетания антигенов других систем: положительные и отрицатель­ные по антигенам Fy^a, Fy^b и Кидд.

Необходимы Келл-положительные образцы. Некоторые из них могут быть Челлано-отрицательные. Келл-положительные образцы подразделяются также в зависи­мости от наличия или отсутствия в них антигенов Даффи.

Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить специ­фичность в пределах этих систем эритроцитов, что очень важно, так как антитела анти-Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте после антител антирезус.

Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами этой системы – Jk^а-, Jk^b-, Le^a+, Le^b-.

И, наконец, в панели представлены фенотипы эритроцитов других систем: MNSs, Р, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.

Использование представленной панели стандартных эритроцитов дает воз­можность выявлять и определять специфичность полных и неполных антител всех серологических систем как в том случае, когда эти антитела одной специфич­ности, так и в других – когда антитела различаются и по специфичности, и по форме.

В практической работе исследование следует начинать в следующем порядке: сначала используются выборочно 10-12 образцов эритроцитов, подобранных с таким расчетом, чтобы выявить сенсибилизацию к любому из основных антигенов резус – D, С, Е, с, е, С^w. Среди резус-отрицательных включаются образцы с максимальным набором различных антигенов.

Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной специфичности или их сочетание, агглютинация наступит также с соответствующими образца­ми эритроцитов.

Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы, имеющие анти­гены Fy или Келл, следует произвести дополнительные исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные эритроциты независимо от антиге­нов Fy и Келл, то панель для исследования следует еще более расширить включением образцов с различными сочетаниями антигенов по системам Кидд, Левис, MNSs и т.д.

Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для первичного исследо­вания, независимо от резус-принадлежности, следует провести дополнительные ис­следования с использованием стандартных эритроцитов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами свидетельствует о наличии соответствующих антител – анти-с и анти-е.

При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует иметь в виду другие, широко распространенные антигены, например, Челанно, и поэтому использовать Челанно-отрицательные стандартные эритроциты.

В случае положительного результата и с этим стандартом следует расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить наличие в сыворотке нескольких антител.

7. Титрование сыворотки

После выявления антител и установления их специ­фичности и формы следует определить титр антител. Титрование проводится от­дельно для неполных и полных антител непрямой пробой Кумбса, в методе кон-глютинации с желатином и реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию сывороток антирезус. Для титрования используют образцы эритроцитов, содержащие антиген, против которого направлены антитела. По возможности тит­рование проводится с гомозиготными и гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом дозы и, будучи активными с гомозиготными образцами (сс), могут ока­заться неактивными и дать ложноотрицательный результат при исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о возможности практического использования таких сывороток учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается на этикетке.

Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки дает возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая сыворотка, имеющаяся в доста­точном количестве, для дальнейшего ее использования должна быть обработана и расфасована, как указано в пункте 9. Сыворотки-сырье хранят в течение 3 недель при температуре +4 – +8°С, после чего проводится их стандартизация.

8. Стандартизация сыворотки

Стандартизация редких сывороток производится на станциях пере-ливания крови, располагающих необходимой панелью типированных стандартных эритроцитов 0(I) группы. При стандартизации производят исследования, предусмот­ренные в пункте 7 настоящей инструкции. Результаты сопоставляют с данными, указанными на этикет­ке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.

При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой специ­фичности, формы и титра антитела содержатся в данной сыворотке и для опреде­ления какого (каких) антигена (ов) и в какой именно реакции пригодна данная сыво­ротка.

Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в пункте 5, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже требуемого, и при этом правильно оформлены этикетки и наставление по использованию, то учреждение, прово­дившее стандартизацию, дает заключение о возможности использования данной сыворотки как стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение, представившее сыворотку для стандартизации.

В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с указанием причин не­пригодности сыворотки или неправильности, имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по возможному устранению отмеченных недостатков. При затруднении проведения стандартизации редкие сыворотки направляются в ГУ «РНПЦГТ».

9. Обработка и расфасовка сыворотки

После того, как у сенсибилизированного лица при первичном исследовании сыворотки выявлены редкие антитела, из его крови получают сыворотку или плазму методом плазмафереза. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл сыворотки или азидом натрия – 1 г на 1000 мл. К плазме для уда­ления фибрина добавляют 10 %-ый раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на 100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в другой флакон и также консервируют.

На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием фамилии, имя и отчества доно­ра, групповой принадлежности по системе АВ0 и характеристики изоиммунных анти­тел с теми подробностями, которые удалось выявить при первичном исследовании. Сыворотку хранят при температуре +4 – +8°С. Через два-три дня сыворотку вновь исследуют на наличие, специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 7 настоящей инструкции. Результат исследова­ния записывают на этикетке сосуда с сывороткой и регистрируют в журнале.

Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как описано выше. Флаконы с сывороткой хранят при температуре +4 – +8°С.

Если показатели специфичности и активности (титра) антител и внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 5, сыворотку можно считать пригодной для практического использования и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в зависимости от предполагаемых объемов использо­вания. Чем больше редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки сыворотки.

Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.

Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется специ­фичность, форма и активность антител, проверяется правильность паспортизации и решается вопрос о возможности использования этой сыворотки в методе, реко­мендуемом для практической работы.

Для удаления антител системы АВ0 проводится абсорбция эритроцитами соответствующей групповой принадлеж­ности с отсутствием в них антигена, против которого в сыворотке имеются изоиммунные антитела. Абсорбция или нейтрализация антител a и b проводится после исследования сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до ее расфасовки.

После абсорбции и еще через три недели сыворотку исследуют на наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и титр изоиммунных анти­тел. Если групповые антитела a и bисчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям, указанным в пункте 5, сыворотку можно расфасовать.

10. Паспортизация редкой сыворотки

На флаконы с расфасованной редкой сывороткой наклеивают этикетки, на которых указывают название организации переливания крови, где изготовлена сыворотка, номер серии, специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Ука­зывается также групповая принадлежность по системе АВ0. Для сыворотки группы AB(IV) или специально абсорбированной вместо символа, обозначающего груп­повую принадлежность, пишутся слова "для всех групп крови". На этикетках нано­сятся по диагонали цветные полосы: для группы A(II) - две синие, для группы В(III) - три красные, для сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые. Возможно печатать этикетки на синем фоне для группы А(II), красные - для группы В(III), желтые - для АВ(IV), вместо символа, обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова «для всех групп крови».

На этикетках указывается количество, срок годности и условия хранения.

11. Хранение и выдача редких сывороток

Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном состоянии при температуре не выше -18°С или при +4 – +8°С. Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд учреждений, в которых они изготовлены, и могут выдаваться в другие организации переливания крови.

При выдаче сыворотки к ней прилагают инструкцию по использованию, в ко­торой указывают, в каком методе для каждого из антител следует использовать данную сыворотку.

При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в целях эконо­мии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии - 1 год, при хранении в условиях при температуре +4 – +8°С – 4 месяца. По истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не снизился или снизился не более, чем на два разведения и при этом сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок продлевают еще на 2 месяца. Если через 2 месяца титр сохранился – срок снова продлевается.

Дополнение 1

Дата добавления: 2015-11-28 | Просмотры: 702 | Нарушение авторских прав