АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Подготовительный этап

1. Нормальную кроличью сыворотку (пул сывороток не менее чем от 20 здоровых кроликов) инактивировать в течение 30 мин при 56 С, развести бидистиллированной или деионизированной водой в соотношении 1:10 (1 часть сыворотки и 9 частей воды), расфасовать по 0,5-1 мл в микропробирки, хранить замороженной (-20^оС) до использования.

2. Фосфатно-забуференный физиологический раствор (ЗФФР) 0,1 М рН 7,2-7,4

1. приготовить раствор № 1:
Na₂HPO₄  12H₂O – 35,8 г на 1 л бидистил.воды*

2. приготовить раствор № 2:
КH₂PO_{4 } 2H₂O - 13,6 г на 1 л бидистил.воды

3. приготовить концентрированный фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4:
0,2 л раствора №2 постепенно прилить в 0,4 л раствора
№1, измерить рН и с помощью раствора №1 довести рН до 7,2-7,4
и добавить азид натрия (конечная концентрация 0,01%), хранить при +4^оС до использования;

4. приготовить ЗФФР: взять 100 мл концентрированного фосфатно-солевого буфера
и добавить 900 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций (использовать в течение 1-2 дней).

3. Специфические и флюороохромированные антитела перед использованием титровать,** хранить при +4^оС и каждый официнальный раствор антител использовать в оптимальной рабочей концентрации.

4. Поли-L-лизин перед использованием титровать (в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя). Рабочий раствор фасовать в микропробирки и хранить при –20^оС до использования. Повторное замораживание не допускается.

5. 30% глицерин готовить из официнального раствора глицерина ч.д.а. и ЗФФР (30 мл глицерина и 70 мл ЗФФР). Хранить при +4^оС до использования.

o *- Соль перед употреблением должна быть высушена в течение не менее 24 часов при 37^оС.

o **- Для каждой новой серии специфических и флюороохромированных антител необходимо подбирать оптимальную рабочую концентрацию. Это можно сделать, обрабатывая клетки, заведомо способные окрашиваться данными антителами, растворами антител разной концентрации (ступенчатое разведение раствора антител в диапазоне, указанном фирмой-изготовителем). Оптимальная концентрация антител

o – это наименьшая концентрация, при которой позитивные клетки еще имеют интенсивное специфическое окрашивание. Эту концентрацию принимают за рабочий титр антител. При несоблюдении этих условий часто можно наблюдать неспецифическое окрашивание клеток.

6. Предметные стекла (76х26х1,5-2,0 мм) не менее чем на 2 часа поместить в смесь Никифорова (1 часть 96^о этилового спирта и 1 часть эфира для наркоза). Парафилм с бумажной основой нарезать прямоугольниками 74х24 мм, сложить их вместе по 4 и дыроколом пробить 8 отверстий таким образом, чтобы между отверстиями было не менее 3 мм. Каждый такой прямоугольник освободить от бумажной основы и, слегка натягивая, наложить на чистое предметное стекло. Парафилм на предметном стекле нагреть над пламенем спиртовки так, чтобы при его расплавлении не образовывались пузыри.

Стекла с парафилмом (каждое отдельно) хранить в алюминевой фольге при комнатной температуре до использования.

7. Влажная камера состоит из чашки Петри, в которую помещают фильтровальную бумагу, смоченную бидистилированной водой и “рельсы” для предметного стекла.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 467 | Нарушение авторских прав