АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы изучения ДНК и РНК

Для выделения ДНК из гомогената тканей удаляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, например, этанолом и после удаления надосадочной жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.

Молекула ДНК среднего размера содержит 150000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см. Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиговым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагментируется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать.

Для фрагментирования используют рестриктазы (« рестирикционные энзимы», эндонуклеазы) - ферменты, выделяемые из бактерий. У бактерий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Название рестриктазы складывается из латинских букв и цифр, отражающих лишь их происхождение (буквы) и разновидность (цифры). Например, эндонуклеаза Pst I. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4-6 нуклеотидов (сайты рестрикции), которые встречаются в ДНК человека и животных. Известно множество различных рестриктаз, в том числе и коммерческих наборов, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции.

С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. Например, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар (н.п.). Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фрагментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) нуклеиновой кислоты. Определенные сложности при определении нуклеотидной последовательности вызваны тем, что имеется всего четыре кодирующих «буквы» и существует высокая вероятность самопроизвольного разрыва молекул по сахарофосфатному остову, даже в результате очень аккуратного пипетирования, из-за их огромных размеров. Перед определением полинуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновых кислот «разрезают» на более мелкие участки, которые затем разделяют, как правило, электрофорезом на полиакриламидном геле (ПААГ, PAGE, SDS-PAGE) или капиллярным электрофорезом (CE). При «резке» нуклеиновых кислот применяют набор различных рестриктаз.

Секвенирование нуклеиновой кислоты позволяет определить в одном эксперименте последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, содержащих несколько сотен мономерных звеньев. Методы основаны на общем принципе - определении с помощью высоко-разрешающего электрофореза в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида длины всех возможных фрагментов секвенируемого участка нуклеиновой кислоты, содержащих на одном конце одну и ту же последовательность нуклеотидов (гомогенный фрагмент), а на другом - один и тот же нуклеотид. Такие фрагменты получают двумя различными способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта) гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному из концов, расщепляют химическими агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотидных остатков (A, G, С, Т или U); в случае РНК этот процесс осуществляют также специфическими рибонуклеазами. Расщепление ведут в таких ограничивающих условиях, когда в каждой молекуле нуклеиновой кислоты расщепляется только одна межнуклеотидная связь рядом с нуклеотидом данного типа, независимо от его положения в цепи. Такую операцию проводят для каждого из четырех нуклеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов определяют положение каждого нуклеотида в цепи нуклеиновой кислоты

В другом случае (метод Сенгера) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, коплементарную определенному участку нуклеиновой кислоты Затравку наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к смеси четырех природных субстратов ДНК-полимеразы добавляют так называемый терминатор (обычно 2′, 3′-ди-дезоксинуклеозидтрифосфат) - аналог определяемого нуклеотидного остатка, попадание которого на 3′-конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в затравку, либо в субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидов. Эти методы в настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенирования ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения некоторых исследований необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК и получить за 3-4 ч несколько миллионов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д.

Гибридизация. Для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот применяют метод гибридизации. Он основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80-90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использование метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Методом гибридизации можно установить сходство и различия первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1649 | Нарушение авторских прав