АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Проверка модели Уотсона-Крика

Модель двойной спирали ДНК была предложена в 1953 г. и знаменовала рождение новой науки-молекулярной биологии. Однако прошло пять лет, прежде чем были получены первые убедительные экспериментальные подтверждения модели Уотсона-Крика в работах Мэтью Мезелсона и Франклина Сталя. В этих экспериментах было показано, что в точном соответствии с предсказаниями модели репликация ДНК происходит полу консервативно: каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной интактной (консервативной) цепи, полученной от родительской

4. Природа генетического материала 109

Рис. 4.13. Предложенная Уотсоном и Криком модель репликациидвойной спирали ДНК.

двойной спирали, и одной вновь синтезированной цепи. С другой стороны, можно представить себе гипотетические механизмы репликации ДНК, которые не предсказываются моделью двойной спирали, а именно: 1) консервативный способ репликации, при котором родительская ДНК полностью сохраняется, а дочерние молекулы ДНК полностью синтезируются заново, и 2) дисперсный способ, при котором обе дочерние молекулы ДНК синтезируются заново, а родительская молекула распадается на нуклеотиды, которые могут входить или не входить в состав дочерних молекул.

110 Организация и передача генетического материала

Рис. 4.14. Разделение молекул ДНК с различной плотностью посредством центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Схематически изображены последовательные этапы эксперимента Мезелсона и Сталя, показавшего полуконсервативный механизм репликации ДНК Е. coli.

4. Природа генетического материала 111

Чтобы определить, каким из этих способов реплицируется ДНК. надо уметь отличать дочерние молекулы от родительских. Мезелсон и Сталь выращивали Е. coli на среде, содержащей в качестве источника азота ¹⁵N. Тяжелый изотоп азота ¹⁵N включался в состав ДНК и служил меткой. Для того чтобы пометить изотопом ¹⁵N практически всю бактериальную ДНК, достаточно вести культивирование на такой среде в течение двенадцати поколений. Молекулы, содержащие ¹⁵N, можно отличить от молекул, содержащих более легкий, обычный изотоп, по плотности, так как у ДНК с ¹⁵N масса одного нуклеотида больше, чем у обычной ДНК. Молекулы ДНК с различной плотностью могут быть разделены центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (рис. 4.14). В процессе центрифугирования молекулы ДНК собираются в том слое, в котором плотность раствора равна их собственной плотности. ДНК клеток Е. coli, выращенных на среде, содержащей ¹⁵N, имеет плотность 1,724 г/см³, тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом ¹⁴N, имеет плотность 1,710 г/см³. Смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при центрифугировании по плотности (рис. 4.14).

Аналогией, иллюстрирующей принцип центрифугирования в градиенте плотности, может служить погружение подводной лодки. Регулируя количество воды в балластных танках (баках), подводная лодка может зависать на желаемой глубине, плотность воды на которой равна средней плотности подводной лодки. Если набрать в танки больше воды, вытеснив соответствующее количество воздуха, то плотность подводной лодки увеличивается, и она погружается, попадая в слои более холодной воды с большей плотностью. Когда плотность воды оказывается равной плотности подводной лодки, лодка снова зависает на новой глубине.

В эксперименте Мезелсона и Сталя клетки, в течение многих поколений культивируемые на среде с ¹⁵N, быстро переносили в среду, содержавшую ¹⁴N. Через определенные промежутки времени отбирали пробы растущей культуры и в каждой из них определяли плотность ДНК. Результаты представлены на рис. 4.15. После первого деления на среде с ¹⁴N плотность ДНК культуры была промежуточной между [¹⁵N] ДНК и [¹⁴N] ДНК. После второго деления на среде с ¹⁴N половина клеток имела легкую ДНК, а вторая половина - ту же, что и в предыдущем поколении (промежуточную). После третьего деления на среде с ¹⁴N 3/4 ДНК имело плотность, равную плотности [¹⁴N] ДНК и 1/4 сохраняла промежуточную плотность. Соотношение между числом генераций и распределением плотности ДНК в точности соответствовало полуконсервативному типу репликации, предсказываемому моделью Уотсона-Крика (рис. 4.15).

Кроме того, модель предсказывала, что ДНК с промежуточной плотностью должна представлять собой гибридную двойную спираль, одна из цепей которой содержит только тяжелый изотоп азота (N¹⁵), а другая-только легкий. Мезелсон и Сталь нагревали ДНК промежуточной плотности в течение 30 мин при температуре 100°С, что, как уже было известно, изменяет физические свойства молекулы, не разрывая ковалентных связей, и обнаружили, что она превращается в две равные по объему фракции ДНК с разными плотностями. Плотность одной из фракций, образовавшихся в результате нагревания, совпадала с плотностью тяжелой ДНК, а другой-с плотностью легкой ДНК (рис. 4.15).

112 Организация и передача генетического материала

Рис. 4.15. А. Распределение плотности молекул ДНК, наблюдавшееся Мезелсоном и Сталем после перенесения растущих клеток Е. coli из тяжелой среды в легкую. Б. Схематическая интерпретация результатов, представленных на А. ДНК, меченная 15N, и вновь синтезируемая ДНК, имеющая 14N, изображены разным цветом. В. Нагревание ДНК промежуточной плотности превращает ее в одноцепочечную ДНК, содержащую две фракции, плотность одной из которых совпадает с плотностью нагретой ДНК, меченной 15N, а другой -меченной 14N.

4. Природа генетического материала 113

Из этого было сделано заключение, что ДНК промежуточной плотности, образующаяся после первого деления в легкой среде, представляет собой гибридную молекулу, состоящую из одной родительской цепи, содержащей только тяжелый изотоп азота, и другой, вновь синтезированной дочерней цепи, как это предсказывает модель Уотсона-Крика. Аналогичные эксперименты проделывали с реплицирующейся ДНК множества различных прокариотических и эукариотических организмов, и каждый раз оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты Мезелсона-Сталя были первым доказательством справедливости модели Уотсона - Крика. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что основные положения этой модели убедительно подтверждены и структура двойной спирали легла в основу современной генетики.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 567 | Нарушение авторских прав