АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Характеристика культур клеток

Популяцию клеток тканей, которая способна развиваться и существовать in vitro (в пробирке), называют культурой клеток.

Впервые методику приготовления культур клеток предложили Дульбекко и Фогт в 1952 г. Внастоящее время в практику вирусологических исследований внедрены несколько видов культур клеток:

1) Первичные трансинизированные – популяции клеток, полученные из тканей, взятых непосредственно из организма. Для приготовления первичных культур клеток используют органы (почки, тимус, легкие, тестикулы (яички) эмбрионов или новорожденных животных). Хорошо известна культура куриные фибробласты, эпителий и мышцы куриного эмбриона, образующие слой в толщину клетки на поверхности стекла. Почка эмбриона теленка, поросенка представляет почечный эпителий, выросший и прикрепленный к стеклу. Первичные культуры характеризуют как монослойные и прикрепленные.

В развитии популяции клеток установлено 4 фазы роста: 1)адаптации 2)логарифмического роста 3)стационарная 4)старение.

2) Субкультуры получают из первичных снятием со стекла и ресуспензированием в новой питательной среде. Они выдерживают 3-5 переливаний. Субкультур, полученные из вех первичных, кроме куриных фибробластов.

3) Полуперевиваемые диплоидные – морфологически однородная стабилизированная популяция клеток, имеющая ограниченный срок жизни с тремя фазами роста, сохраняющая кариотип, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной и туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Впервые диплоидную клеток ВНК-21 (почка хомяка) получили Хейфлик, Мурхед в 1961 г. Полуперевиваемые культуры клеток получены из тканей эмбрионов (почка теленка, свиньи). Полуперевиваемые культуры клеток могут быть жизнеспособными в течение 10-12 дней, если переливать еженедельно – живут 4 недели, выдерживая до 50 переливаний.

4) Перевиваемые культуры клеток – популяции клеток тканей, способные к размножению in vitro неограниченное время. Переливаемые культуры клеток специально получены в результате селекции единичных клеток эмбриональной ткани и злокачественных опухолей. Известны переливаемые культуры клеток из злокачественных опухолей Hella – карцинома, Hep-3 – лимфоидная карцинома, КВ – карционома. В ветеринарной вирусологии широко применяют переливаемые культуры клеток из эмбриональных тканей – СПЭВ (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППТ (перевиваемая почка теленка), ППО (перевиваемая почка овцы), ТR (трахея коровы), L (мышиные фибробласты), COLS (сердце обезьяны). Современные перевиваемые культуры клеток ПГ80, Т1 (почка теленка), ЛЭВ (легкое эмбриона коровы), WERO (почка зеленой мартышки), КСТ (коронарные сосуды теленка).

5) Суспензионные культуры клеток – популяция клеток, не прикрепленная к стенкам пробирок, находятся в свободном состоянии.

Многие перевиваемые культуры клеток превращены в суспензионные (ВНК21, Hep-2, МДВК). Лучшие накопления суспензионных клеток получают при использовании носителей: сефадекс, силикагель, фитолат. Культуры клеток при длительном использовании консервируют: +4⁰С в течение 1-6 недель; -78⁰С – сухой лед; -196⁰С в жидком азоте. Консервирование включает: снятие клеток, суспензирование в питательной среде с добавлением 10-40 % сыворотки, 10 % ДНСО, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, мономицин, гентамицин) в дозе 100 мкг/мл и больше. Расфасовку в ампулы и замораживание. Ампулы с замороженными клетками можно транспортировать при 40⁰С, живые 7-8 дней. Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,25 % трипсина на фосфатном буфере, раствор Версена (натриевая соль диаминтетрауксусной кислоты на 0,02 % растворе Хенкса). Растворы Хенкса, Эрла содержат соли, глюкозу, индикатор на бидистиллированной воде. Восстанавливают размораживаем, затем вносят питательную среду, которую на другой день меняют.

Выращивают культуры клеток на питательных средах, естественных и искусственных, синтетические и полусинтетических.

Естественные питательные среды – это смесь раствора Хенкса, Эрла и сыворотки крови, эмбрионального экстракта (используют редко).

Искусственные полусинтетические – ферментативные гидролизаты, казеиновый гемогидролизат, аминопептид, лактоальбумины (в окличестве 2,5-5 %).

Искусственные синтетические. Среда 199 (содержит 60 компонентов), среда Игола.

Указанные среды имеют рН 7,2-7,4. Содержат индикатор феноловый красный и имеют красный цвет. При снижении рН желтеют. При повышении приобретают красно-малиновый оттенок.

По назначению питательные все питательные среды для культур клеток подразделяют на ростовые – обеспечивают жизнь, размножение клеток, содержат сыворотку крови (телят, эмбриональную КРС); поддерживающие – обеспечивают существование клеток после заражения вирусом.

Типы взаимодействия вирусов с клеткой.

Известно 7 типов взаимодействия вирусов с клетками.

1)Разные патологические изменения от угнетения функциональной активности до повреждения структур клеток. Впервые повреждение структур клеток обнаружил Хуан, Эндерс в 1943 г. Такое действие вируса они называли цитопатогенным (ЦПД). Современное название – цитопатический эффект ЦПЭ. Сущность ЦПД заключается в угнетении митоза, влиянии на хромосомный аппарат, лизисе клеток, отчего в культурах клеток возникает феномен бляшкообразования. Влияние ЦПД вирусов на митоз макро-, микроскопически проявляется появлением округлых клеток, образованием симпластов (гигантских многоядерных клеток), образование синтициев, конгломератов в цитоплазме, содержащих сотни тысячи ядер, что происходит в результате массовой гибели клеток.

2)

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 676 | Нарушение авторских прав