Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Альбертом Кунсом в 1942 году. Данный метод для ранней диагностики инфекционных заболеваний животных в ветеринарии начал изучать П.И.Притулин в 1955 году.
Принцип данного методазаключается в том, что антитела, предварительносоединенные с флуорохромами, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном.Образующийся комплекс антиген-антителообнаруживаютподлюминесцентным микроскопом по характерномусвечению благодаря присутствию в немфлуорохрома.В качествекрасителя антител наиболее часто применяютФИТЦ — флуоресцеина изо-тиоцианат(зеленоесвечение) и РСХ — родамина сульфохлорид (красноесвечение).
Метод иммунофлуоресценции сочетаетв себе специфичность серологических реакций и морфологического метода исследования. Его применяют для:
1) индикации, идентификации вирусов и вирусных антигенов вразличных объектах;
2) выяснения локализации вирусов при изучении патогенеза инфекции;
3) определения местонахождения нормальных и иммунных глобулинов;
4) уточнения антигенного родства вирусов и др.
Одно из главных преимуществ метода иммунофлуоресценции перед другими серологическими реакциями состоит в том, что при его применении значительно сокращается время и не требуется большой массы антигена. При использовании строго специфических, хорошо оттитрованных сывороток можно весьма точно поставить диагноз.
Различают два основных способа диагностического применения метода иммунофлуоресценции: прямой и непрямой. При использовании прямого, или одноступенчатого метода для идентификации различных вирусных антигенов применяют соответствующие флуоресцирующие антитела диагностических сывороток, непосредственно обрабатывая ими препараты из исследуемого материала.
При непрямом, или двухступенчатом, способе антиген вначале обрабатывают гомологичными нефлуоресцирующими антителами (1-ая ступень) затем для обнаружения последних, а вместе с ними и искомого антигена, применяют соответствующую им флуоресцирующую сыворотку против антител-глобулинов животного определенного вида: кролик, бык и т.д. (2-ая ступень). Кроме того, вирусный антиген может быть соединен с антисывороткой и комплементом (1-ая ступень), а затем обработан флуоресцирующей сывороткой против комплемента (2-ая ступень, принцип РСК). Непрямой способ более чувствительный, так как каждое антитело 1-ой ступени, применяемое для выявления антигена, многовалентно и может присоединить к себе несколько флуоресцирующих антител 2-ой ступени. Соответственно повышается и сила свечения искомых антигенов.
В качестве объектов исследования можно использовать препараты-отпечатки и мазки, гистосрезы, культуры клеток и т.д. Предметные стекла должны быть тонкими, чистыми, обезжиренными, бесцветными и не иметь царапин. Для итого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром.
Рис. 2 Схема методов обработки препаратов флуоресцирующими антителами
Препараты-отпечатки и мазки готовят следующим образом. Патологический материал помещают в металлическую ванночку, прижигают сверху раскаленным металлическим шпателем, вырезают из этого участка стерильным скальпелем небольшой кусочек и поверхностью разреза 2-3 раза прикасаются к предметному стеклу (отпечаток) или проводят по нему (мазок).
Препараты из культур клеток получают на покровных стеклах, предварительно вложенных в пробирки, где развивается клеточный пласт (монослой). Затем их отмывают физиологическим раствором от питательной среды, высушивают и фиксируют. При этом выбирают такой фиксатор, который не приводит к растворению вирусных антигенов и не нарушает их иммунологической специфичности. Чаще всего для этих целей применяют чистый ацетон, охлажденный до минус (10...15) °С, метиловый или этиловый спирт. Фиксируют препараты 10...15 мин. В таком состоянии их можно хранить долго.
При использовании прямого метода на препарат наносят 1-2 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Продолжительность окрашивания — 30 мин. Для предупреждения высыхания препараты помещают в большие чашки Петри с ватными тампонами, смоченными водой (влажная камера). Затем их тщательно промывают физраствором, можно водопроводной водой. Препараты подсушивают и микроскопируют.
При применении непрямого метода препарат вначале обрабатывают 30 мин во влажной камере антивирусной специфической сывороткой. Сыворотку смывают водопроводной водой. На подсушенные препараты наносят на 30 мин флуоресцирующую сыворотку против глобулинов того вида животных (кролика, быка, лошади и т.д.), на которых получена специфическая сыворотка против данного антигена. Затем препараты промывают, подсушивают и микроскопируют.
При обработке препаратов с применением комплемента (2-ой вариант непрямого метода) вначале наносят смесь нефлуоресцирующей сыворотки с комплементом, а потом — антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку. Для каждого этапа предусмотрена 20...30 минутная экспозиция во влажной камере помещенной в термостат. Препараты хорошо промывают, высушивают и просматривают под микроскопом.
В ходе самостоятельной работы студентов необходим о
1. Ознакомиться с набором флуоресцирующих сывороток 1 наставлениями по их применению.
2. Обработать препараты прямым методом иммунофлуоресценции.
3. Просмотреть приготовленные препараты в микроскопе I зарисовать в тетрадь.
Примерный план занятия (2 ч)
1. Контрольный опрос.
2. Объяснения преподавателя.
3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация набора флуоресцирующих сывороток; б) положительных препаратом Ауески, ПГ-3 и др.