АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Аль­бертом Кунсом в 1942 году

Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Аль­бертом Кунсом в 1942 году. Данный метод для ранней диагности­ки инфекционных заболеваний животных в ветеринарии начал изучать П.И.Притулин в 1955 году.

Принцип данного методазаключается в том, что антитела, предварительносоединенные с флуорохромами, сохраняют спо­собность вступать в специфическую связь с гомологичным анти­геном.Образующийся комплекс антиген-антителообнаруживаютподлюминесцентным микроскопом по характерномусвечению благодаря присутствию в немфлуорохрома.В качествекрасителя антител наиболее часто применяютФИТЦ — флуоресцеина изо-тиоцианат(зеленоесвечение) и РСХ — родамина сульфохлорид (красноесвечение).

Метод иммунофлуоресценции сочетаетв себе специфичность серологических реакций и морфологического метода исследова­ния. Его применяют для:

1) индикации, идентификации вирусов и вирусных антиге­нов вразличных объектах;

2) выяснения локализации вирусов при изучении патогенеза инфекции;

3) определения местонахождения нормальных и иммунных глобулинов;

4) уточнения антигенного родства вирусов и др.

Одно из главных преимуществ метода иммунофлуоресценции перед другими серологическими реакциями состоит в том, что при его применении значительно сокращается время и не тре­буется большой массы антигена. При использовании строго спе­цифических, хорошо оттитрованных сывороток можно весьма точно поставить диагноз.

Различают два основных способа диагностического приме­нения метода иммунофлуоресценции: прямой и непрямой. При использовании прямого, или одноступенчатого ме­тода для идентификации различных вирусных антигенов приме­няют соответствующие флуоресцирующие антитела диагностиче­ских сывороток, непосредственно обрабатывая ими препараты из исследуемого материала.

При непрямом, или двухступенчатом, способе антиген вна­чале обрабатывают гомологичными нефлуоресцирующими анти­телами (1-ая ступень) затем для обнаружения последних, а вместе с ними и искомого антигена, применяют соответствующую им флуоресцирующую сыворотку против антител-глобулинов живот­ного определенного вида: кролик, бык и т.д. (2-ая ступень). Кро­ме того, вирусный антиген может быть соединен с антисыворот­кой и комплементом (1-ая ступень), а затем обработан флуоресцирующей сывороткой против комплемента (2-ая ступень, принцип РСК). Непрямой способ более чувствительный, так как каждое антитело 1-ой ступени, применяемое для выявления анти­гена, многовалентно и может присоединить к себе несколько флуоресцирующих антител 2-ой ступени. Соответственно повыша­ется и сила свечения искомых антигенов.

В качестве объектов исследования можно использовать пре­параты-отпечатки и мазки, гистосрезы, культуры клеток и т.д. Предметные стекла должны быть тонкими, чистыми, обезжирен­ными, бесцветными и не иметь царапин. Для итого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром.

При использовании прямого метода на препарат наносят 1-2 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Продолжительность окрашивания — 30 мин. Для предупреждения высыхания препараты помещают в большие чашки Петри с ватными тампонами, смоченными водой (влажная камера). Затем их тщательно промывают физраствором, можно водопроводной водой. Препараты подсушивают и микроскопируют.

При применении непрямого метода препарат вначале обрабатывают 30 мин во влажной камере антивирусной специфической сывороткой. Сыворотку смывают водопроводной водой. На подсушенные препараты наносят на 30 мин флуоресцирующую сыворотку против глобулинов того вида животных (кролика, быка, лошади и т.д.), на которых получена специфическая сыворотка против данного антигена. Затем препараты промывают, подсушивают и микроскопируют.

При обработке препаратов с применением комплемента (2-ой вариант непрямого метода) вначале наносят смесь нефлуоресцирующей сыворотки с комплементом, а потом — антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку. Для каждого этапа предусмотрена 20...30 минутная экспозиция во влажной камере помещенной в термостат. Препараты хорошо промывают, высушивают и просматривают под микроскопом.

В ходе самостоятельной работы студентов необходим о

1. Ознакомиться с набором флуоресцирующих сывороток 1 наставлениями по их применению.

2. Обработать препараты прямым методом иммунофлуоресценции.

3. Просмотреть приготовленные препараты в микроскопе I зарисовать в тетрадь.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация набора флуоресцирующих сывороток; б) положительных препаратом Ауески, ПГ-3 и др.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 633 | Нарушение авторских прав