АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение.

Цель занятия: освоить различные методы заражения и ме­тодику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать технику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови.

Оборудование и материалы: лабораторные животные (кро­лики, белые мыши, морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий ма­териал, трупы лабораторных животных, пенициллин, стрептомицин, стерильные инструменты для вскры­тия, раствор Хенкса, пробки резино­вые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, пробирки, колбочки на 50 мл, воронка, пробирки центрифужные, физио­логический раствор, штативы, центрифуга, таблицы по теме.

Издавна лабораторных животных применяют для индика­ции вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С этой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологиче­ской практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, ящура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4).

Таблица 4.

Восприимчивость лабораторных животных к вирусам

Обычно признаки присутствия вируса в организме животно­го малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой это вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождает­ся характерной клинической картиной, специфичной для опреде­ленного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только о присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — зараже­ние вирусом болезни Ауески.

В настоящее время лабораторных животных используют для:

1) обнаружения вируса в патматериале;

2) первичного выделения вируса из патматериала;

3) накопления вирусной массы;

4) поддержания вируса в активном состоянии;

5) титрования вируса;

6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации;

7) получения гипериммунных сывороток.

При выполнении биопробы необходимы лабораторные жи­вотные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, мор­ские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабора­торные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный вес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорож­денные, в других — можно использовать взрослых).

Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабо­раторные исследования для исключения инфекционных и инва­зионных болезней. Помещение, где содержатся животные, долж­но иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необ­ходимо содержать в отдельном помещении.

Метка лабораторных животных. Метка является непре­менным условием использования животных в эксперименте. На клетке укрепляют бирку с надписью (номер экспертизы, количе­ство зараженных животных, дату заражения и другие сведения).

Существуют и способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу (курам).

Для метки белых мышей и крыс чаще всего применяют нанесение цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесе­ние цветных меток начинают с левого верх­него угла, т.е. лопатки; это будет соответст­вовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее за­тылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения еди­ниц, другим — десятков.

Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных раз­ными способами, но с учетом тропизма ви­руса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей группы животных. Обычно делают обычно три "слепых" пассажа.

Вируссодержащий материал может быть введен лаборатор­ным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, мате­риал вводят в органы, содержащие чув­ствительные к этому вирусу клетки. На­пример, вирус гриппа вводят интраназально, вирус бешенства — интрацеребрально.

Применяют следующие методы зара­жения.

Заражение под кожу: вируссодержащий материал вводят под кожу в область спины. Доза его для крыс— 0,5 мл, морских свинок— 3 мл, белых мышей — 0,2 мл. Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъециру­ют в разные места под задний ко­нец спины или в различных на­правлениях.

Внутримышечное заражение: исследуемый материал вводят в мышцу бедра (у кур — в грудную мышцу). Доза для мышей 0,25 мл, крыс— 0,5...1 мл, морских свинок — 2 мл, кроликов — 5 мл, кур — 3 мл.

Внутрикожное заражение: тон­кую острую иглу вводят под ост­рым углом в складку кожи, пред­варительно освобожденную от волос. В результате инъекции дол­жен образоваться пузырек. Доза вируссодержащего материала для всех животных 0,1...0,2 мл.

Накожное заражение: на предварительно подготовленной (освобожденной от шерсти) продезинфицированной коже скари­фикатором делают царапины, затем каплями наносят вируссодержащий материал и втирают стеклянным шпателем, этот метод широко используют при работе с вирусами оспенной группы

Внутрибрюшинное заражение: животное фиксируют в верти­кальном положении головой вниз. Для инъекции используют затупленные иглы. Кожу, мышечную стенку и брюшину за­бирают в складку и прокалывают их иглой под прямым углом до ощущения пустоты — показатель проникно­вения иглы в брюш­ную полость. Дозы вируссодержащего материала: мышам— 1 мл, крысам— 2 мл, морским свинкам— до 5 мл, кроликам— до 10 мл, овцам и козам — 50...100 мл.

Внутривенное заражение: исследуемый материал мышам и крысам вводят в хвостовую вену, кроликам — в ушную, курам — в вену крыла, более крупным животным — в яремную вену, мор­ским свинкам— 1...2 мл непосредственно в сердце. У мышей и крыс хвост надо предварительно погрузить на 5...10 мин в теплую воду (48...50 °С). Иглу вводят под острым углом в боковую вену эадней трети хвоста. Дозы материала: для мышей — 1 мл, крыс — 2 мл, кроликов — до 5 мл, для кур — до 10 мл.

Интраназальное заражение: стерильной пипеткой в носовое отверстие вносят каплю исследуемого материала, которую животные при вдохе аспирируют в легкие. Материал не должен содержать высокодисперсных частиц. Наркоз должен быть глубоким, противном случае у животного возникает чихательный рефлекс материалом инфицируется окружающая среда. Дозы: для мышей— 0,03...0,05 мл, крыс— 0,05...0,1 мл, морских свинок и кроликов —до 2 мл.

Внутримозговое заражение: мышей и крыс заражают под наркозом, так и без него. Введение вируссодержащего материала осуществляют на расстоянии 1...2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей углы глаз. Место укола дезинфицируют раствором йода или спиртом. Используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой, на которую надета резиновая муфта так, чтобы срез иглы был целиком открыт. Мышь фиксируют левой рукой, оттягивая кожу к затылку. Материй вводят постепенно в дозе: для мышей — 0,025...0,03 мл, для крыс — 0,05...0,1 мл.

Кроликов и морских свиной, заражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в черепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к средней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл.

После заражения животные должны быть помещены в клет­ки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количе­ства зараженных животных, да­ты заражения. В рабочем жур­нале записывают номер экспертизы исследуемого мате­риала, количество и характери­стику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связа­на с травмой или токсическим действием исследуемого материа­ла.

В последующие дни после заражения, ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Од­нако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболе­вание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью серологических реакций.

Вскрытие лабораторных животных. Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального и. проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 3..8...10 день после заражения. Убить животное рекомендуется избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга. Для вскрытия необходимо применять только стерильные инст­рументы: скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей, пинцеты, пастеровские пипетки. Инструменты подбираются так и в таком количестве, чтобы в процессе вскрытия можно было часто менять. Основной принцип при вскрытии — к трупу животного можно прикасаться только инструментами или защищенными руками. Мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки, цыплята) при этом прикалывают иголками в распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой. Можно, использовать специальные столики (рис.49), снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями. Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены в больших кюветах.

Перед вскрытием труп животного дезинфицируют: мелких животных погружают в 2,5%-ный раствор фенола на10...15 мин, крупных - опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты.

В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудат и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры.

После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1275 | Нарушение авторских прав