Цель занятия: освоить различные методы заражения и методику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать технику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови.
Оборудование и материалы: лабораторные животные (кролики, белые мыши, морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий материал, трупы лабораторных животных, пенициллин, стрептомицин, стерильные инструменты для вскрытия, раствор Хенкса, пробки резиновые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, пробирки, колбочки на 50 мл, воронка, пробирки центрифужные, физиологический раствор, штативы, центрифуга, таблицы по теме.
Издавна лабораторных животных применяют для индикации вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С этой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологической практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, ящура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4).
Обычно признаки присутствия вируса в организме животного малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой это вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождается характерной клинической картиной, специфичной для определенного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только о присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — заражение вирусом болезни Ауески.
В настоящее время лабораторных животных используют для:
1) обнаружения вируса в патматериале;
2) первичного выделения вируса из патматериала;
3) накопления вирусной массы;
4) поддержания вируса в активном состоянии;
5) титрования вируса;
6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации;
7) получения гипериммунных сывороток.
При выполнении биопробы необходимы лабораторные животные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, морские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабораторные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный вес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорожденные, в других — можно использовать взрослых).
Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабораторные исследования для исключения инфекционных и инвазионных болезней. Помещение, где содержатся животные, должно иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необходимо содержать в отдельном помещении.
Метка лабораторных животных. Метка является непременным условием использования животных в эксперименте. На клетке укрепляют бирку с надписью (номер экспертизы, количество зараженных животных, дату заражения и другие сведения).
Существуют и способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу (курам).
Для метки белых мышей и крыс чаще всего применяют нанесение цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных меток начинают с левого верхнего угла, т.е. лопатки; это будет соответствовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее затылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения единиц, другим — десятков.
Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных разными способами, но с учетом тропизма вируса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей группы животных. Обычно делают обычно три "слепых" пассажа.
Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус бешенства — интрацеребрально.
Применяют следующие методы заражения.
Заражение под кожу: вируссодержащий материал вводят под кожу в область спины. Доза его для крыс— 0,5 мл, морских свинок— 3 мл, белых мышей — 0,2 мл. Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъецируют в разные места под задний конец спины или в различных направлениях.
Внутримышечное заражение: исследуемый материал вводят в мышцу бедра (у кур — в грудную мышцу). Доза для мышей 0,25 мл, крыс— 0,5...1 мл, морских свинок — 2 мл, кроликов — 5 мл, кур — 3 мл.
Внутрикожное заражение: тонкую острую иглу вводят под острым углом в складку кожи, предварительно освобожденную от волос. В результате инъекции должен образоваться пузырек. Доза вируссодержащего материала для всех животных 0,1...0,2 мл.
Накожное заражение: на предварительно подготовленной (освобожденной от шерсти) продезинфицированной коже скарификатором делают царапины, затем каплями наносят вируссодержащий материал и втирают стеклянным шпателем, этот метод широко используют при работе с вирусами оспенной группы
Внутрибрюшинное заражение: животное фиксируют в вертикальном положении головой вниз. Для инъекции используют затупленные иглы. Кожу, мышечную стенку и брюшину забирают в складку и прокалывают их иглой под прямым углом до ощущения пустоты — показатель проникновения иглы в брюшную полость. Дозы вируссодержащего материала: мышам— 1 мл, крысам— 2 мл, морским свинкам— до 5 мл, кроликам— до 10 мл, овцам и козам — 50...100 мл.
Внутривенное заражение: исследуемый материал мышам и крысам вводят в хвостовую вену, кроликам — в ушную, курам — в вену крыла, более крупным животным — в яремную вену, морским свинкам— 1...2 мл непосредственно в сердце. У мышей и крыс хвост надо предварительно погрузить на 5...10 мин в теплую воду (48...50 °С). Иглу вводят под острым углом в боковую вену эадней трети хвоста. Дозы материала: для мышей — 1 мл, крыс — 2 мл, кроликов — до 5 мл, для кур — до 10 мл.
Интраназальное заражение: стерильной пипеткой в носовое отверстие вносят каплю исследуемого материала, которую животные при вдохе аспирируют в легкие. Материал не должен содержать высокодисперсных частиц. Наркоз должен быть глубоким, противном случае у животного возникает чихательный рефлекс материалом инфицируется окружающая среда. Дозы: для мышей— 0,03...0,05 мл, крыс— 0,05...0,1 мл, морских свинок и кроликов —до 2 мл.
Внутримозговое заражение: мышей и крыс заражают под наркозом, так и без него. Введение вируссодержащего материала осуществляют на расстоянии 1...2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей углы глаз. Место укола дезинфицируют раствором йода или спиртом. Используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой, на которую надета резиновая муфта так, чтобы срез иглы был целиком открыт. Мышь фиксируют левой рукой, оттягивая кожу к затылку. Материй вводят постепенно в дозе: для мышей — 0,025...0,03 мл, для крыс — 0,05...0,1 мл.
Кроликов и морских свиной, заражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в черепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к средней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл.
После заражения животные должны быть помещены в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количества зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.
В последующие дни после заражения, ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Однако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью серологических реакций.
Вскрытие лабораторных животных. Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального и. проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 3..8...10 день после заражения. Убить животное рекомендуется избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга. Для вскрытия необходимо применять только стерильные инструменты: скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей, пинцеты, пастеровские пипетки. Инструменты подбираются так и в таком количестве, чтобы в процессе вскрытия можно было часто менять. Основной принцип при вскрытии — к трупу животного можно прикасаться только инструментами или защищенными руками. Мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки, цыплята) при этом прикалывают иголками в распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой. Можно, использовать специальные столики (рис.49), снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями. Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены в больших кюветах.
Перед вскрытием труп животного дезинфицируют: мелких животных погружают в 2,5%-ный раствор фенола на10...15 мин, крупных - опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты.
В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудат и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры.
После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают.