АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение.

Прочитайте:
  1. B) бесполая стадия (шизогания) происходит в организме человека
  2. IX. ДАННЫЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ И ЛАБОРАТОРНЫХ МТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
  3. Авитаминозы протекают в организме очень тяжело и возникают при отсутствии витаминов в организме. Недостаток же тех или иных витаминов чреват для организма гиповитаминозами.
  4. Анатомия застенных желез тонкого отдела кишечника. Топография, назначение, видовые особенности у домашних животных и птиц. Иннервация, кровоснабжение, отток лимфы.
  5. Анатомия изучает строение животных в 3 основных аспектах.
  6. Болезни животных, вызываемые вирусами (вирозы)
  7. В воздухе содержатся примеси разного происхождения: пыль, дым, различные газы. Все это отрицательно сказывается на здоровье людей, животных и жизнедеятельности растений.
  8. В каких случаях мясо животных может быть инфицировано сальмонеллами?
  9. Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии.
  10. Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии.

Цель занятия: освоить различные методы заражения и ме­тодику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать технику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови.

Оборудование и материалы: лабораторные животные (кро­лики, белые мыши, морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий ма­териал, трупы лабораторных животных, пенициллин, стрептомицин, стерильные инструменты для вскры­тия, раствор Хенкса, пробки резино­вые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, пробирки, колбочки на 50 мл, воронка, пробирки центрифужные, физио­логический раствор, штативы, центрифуга, таблицы по теме.

Издавна лабораторных животных применяют для индика­ции вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С этой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологиче­ской практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, ящура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4).

Таблица 4.

Восприимчивость лабораторных животных к вирусам

 

 

Животные Вирус Метод заражения
     
Мыши   Гриппа человека и животных (лошадей, свиней) Интраназально
Хламидии (аборта овец, пневмо­ний, артритов, энцефалитов те­лят) Интранааально, интра-перитонеально
Бешенства Интрацеребрально
Трансмиссивных энцефалитов лошадей Интрацеребрально
Эктромелии (оспы мышей) Внутрикожно, перито-неально
Энцефалита Тейлора Интрацеребрально
Лимфоцитарного хориоменингита Интрацеребрально
Чумы птиц (грипп птиц А1) Интраназально
Новорожденные мыши Ящура Подкожно
Катаральной лихорадки овец Интрацеребрально
    Африканской чумы однокопыт­ных Интрацеребрально
Лихорадки долины Рифт Интрацеребрально
Болезни Найроби Интрацеребрально
Крысы Лимфоцитарного хориоменингита Интрацеребрально
Эктромелии Внутрикожно, интра- перитонеально
Хомяки Гриппа Интраназально
Хламидии Интрахеально
Бешенства Подкожно
Бешенства Интрацеребрально, подкожно, внутримы­шечно, ректально
Морские свинки Ящура Внутрикожно в плантарную поверхность задней лапки
Осповакцины Корнеально
Осповакцины Интрацеребрально
Бешенства Интрацеребрально
Хорьки Гриппа животных Интраназально
Чумы плотоядных Парентерально
Инфекционного гепатита собак Парентерально
Кролики Коровьей оспы Корнеально, внутрикожно
Бешенства Интрацеребрально
Хламидии Интрацеребрально
Миксоматоза Парентерально
Фибромы кроликов Подкожно, внутримы­шечно, тестикулы
Болезни Ауески Подкожно, внутримы­шечно
Ящура Новорожденных крольчат внутримышечно
Ринопневмонии лошадей Беременных крольчих внутримышечно
Собаки Чумы собак Per os внутримышечно
Инфекционного гепатита собак Парентерально
Кошки Энтерита норок Котят до 15 дней рег, парентерально
Панлейкемии кошек Парентерально
Куры Гриппа птиц Парентерально
Ньюкаслской болезни Парентерально
Болезни Марека Парентерально, суточ­ных цыплят интраперитонеально
Инфекционного бронхита Интратрахеально,
Оспы птиц В перьевые фоликулы, гребень, сережки

 

Обычно признаки присутствия вируса в организме животно­го малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой это вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождает­ся характерной клинической картиной, специфичной для опреде­ленного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только о присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — зараже­ние вирусом болезни Ауески.

В настоящее время лабораторных животных используют для:

1) обнаружения вируса в патматериале;

2) первичного выделения вируса из патматериала;

3) накопления вирусной массы;

4) поддержания вируса в активном состоянии;

5) титрования вируса;

6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации;

7) получения гипериммунных сывороток.

При выполнении биопробы необходимы лабораторные жи­вотные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, мор­ские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабора­торные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный вес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорож­денные, в других — можно использовать взрослых).

Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабо­раторные исследования для исключения инфекционных и инва­зионных болезней. Помещение, где содержатся животные, долж­но иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необ­ходимо содержать в отдельном помещении.

Метка лабораторных животных. Метка является непре­менным условием использования животных в эксперименте. На клетке укрепляют бирку с надписью (номер экспертизы, количе­ство зараженных животных, дату заражения и другие сведения).

Существуют и способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу (курам).

Для метки белых мышей и крыс чаще всего применяют нанесение цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесе­ние цветных меток начинают с левого верх­него угла, т.е. лопатки; это будет соответст­вовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее за­тылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения еди­ниц, другим — десятков.

Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных раз­ными способами, но с учетом тропизма ви­руса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей группы животных. Обычно делают обычно три "слепых" пассажа.

Вируссодержащий материал может быть введен лаборатор­ным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, мате­риал вводят в органы, содержащие чув­ствительные к этому вирусу клетки. На­пример, вирус гриппа вводят интраназально, вирус бешенства — интрацеребрально.

Применяют следующие методы зара­жения.

Заражение под кожу: вируссодержащий материал вводят под кожу в область спины. Доза его для крыс— 0,5 мл, морских свинок— 3 мл, белых мышей — 0,2 мл. Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъециру­ют в разные места под задний ко­нец спины или в различных на­правлениях.

Внутримышечное заражение: исследуемый материал вводят в мышцу бедра (у кур — в грудную мышцу). Доза для мышей 0,25 мл, крыс— 0,5...1 мл, морских свинок — 2 мл, кроликов — 5 мл, кур — 3 мл.

Внутрикожное заражение: тон­кую острую иглу вводят под ост­рым углом в складку кожи, пред­варительно освобожденную от волос. В результате инъекции дол­жен образоваться пузырек. Доза вируссодержащего материала для всех животных 0,1...0,2 мл.

Накожное заражение: на предварительно подготовленной (освобожденной от шерсти) продезинфицированной коже скари­фикатором делают царапины, затем каплями наносят вируссодержащий материал и втирают стеклянным шпателем, этот метод широко используют при работе с вирусами оспенной группы

Внутрибрюшинное заражение: животное фиксируют в верти­кальном положении головой вниз. Для инъекции используют затупленные иглы. Кожу, мышечную стенку и брюшину за­бирают в складку и прокалывают их иглой под прямым углом до ощущения пустоты — показатель проникно­вения иглы в брюш­ную полость. Дозы вируссодержащего материала: мышам— 1 мл, крысам— 2 мл, морским свинкам— до 5 мл, кроликам— до 10 мл, овцам и козам — 50...100 мл.

Внутривенное заражение: исследуемый материал мышам и крысам вводят в хвостовую вену, кроликам — в ушную, курам — в вену крыла, более крупным животным — в яремную вену, мор­ским свинкам— 1...2 мл непосредственно в сердце. У мышей и крыс хвост надо предварительно погрузить на 5...10 мин в теплую воду (48...50 °С). Иглу вводят под острым углом в боковую вену эадней трети хвоста. Дозы материала: для мышей — 1 мл, крыс — 2 мл, кроликов — до 5 мл, для кур — до 10 мл.

Интраназальное заражение: стерильной пипеткой в носовое отверстие вносят каплю исследуемого материала, которую животные при вдохе аспирируют в легкие. Материал не должен содержать высокодисперсных частиц. Наркоз должен быть глубоким, противном случае у животного возникает чихательный рефлекс материалом инфицируется окружающая среда. Дозы: для мышей— 0,03...0,05 мл, крыс— 0,05...0,1 мл, морских свинок и кроликов —до 2 мл.

Внутримозговое заражение: мышей и крыс заражают под наркозом, так и без него. Введение вируссодержащего материала осуществляют на расстоянии 1...2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей углы глаз. Место укола дезинфицируют раствором йода или спиртом. Используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой, на которую надета резиновая муфта так, чтобы срез иглы был целиком открыт. Мышь фиксируют левой рукой, оттягивая кожу к затылку. Материй вводят постепенно в дозе: для мышей — 0,025...0,03 мл, для крыс — 0,05...0,1 мл.

Кроликов и морских свиной, заражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в черепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к средней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл.

После заражения животные должны быть помещены в клет­ки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количе­ства зараженных животных, да­ты заражения. В рабочем жур­нале записывают номер экспертизы исследуемого мате­риала, количество и характери­стику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связа­на с травмой или токсическим действием исследуемого материа­ла.

В последующие дни после заражения, ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Од­нако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболе­вание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью серологических реакций.

Вскрытие лабораторных животных. Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального и. проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 3..8...10 день после заражения. Убить животное рекомендуется избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга. Для вскрытия необходимо применять только стерильные инст­рументы: скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей, пинцеты, пастеровские пипетки. Инструменты подбираются так и в таком количестве, чтобы в процессе вскрытия можно было часто менять. Основной принцип при вскрытии — к трупу животного можно прикасаться только инструментами или защищенными руками. Мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки, цыплята) при этом прикалывают иголками в распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой. Можно, использовать специальные столики (рис.49), снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями. Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены в больших кюветах.

Перед вскрытием труп животного дезинфицируют: мелких животных погружают в 2,5%-ный раствор фенола на10...15 мин, крупных - опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты.

В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудат и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры.

После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают.


Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1444 | Нарушение авторских прав







При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.01 сек.)