ЗАНЯТИЕ 2. Подготовка вируссодержащего материала для транспортировки и заражения лабораторных объектов

ЗАНЯТИЕ 5. Люминесцентная микроскопия. Метод иммунофлуоресценции -20ст

ЗАНЯТИЕ 6. Электронная микроскопия вирусов -23ст

ЗАНЯТИЕ 7. Культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) -25ст

ЗАНЯТИЕ 8. Вскрытие куриных эмбрионов. -29ст

ЗАНЯТИЕ 9. Принципы культивирования вирусов в культуре клеток -31ст

ЗАНЯТИЕ 10. Получение первично-трипсинизированных культур клеток из развивающихся куриных эмбрионов -36ст

ЗАНЯТИЕ 11. Перевиваемые культуры клеток -38ст

ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение. –42ст

ЗАНЯТИЕ 13. Принципы титрования вирусов и антисывороток -48ст

Литература -53ст

ЗАНЯТИЕ 1. Структура вирусологической лаборатории и правила работы в ней.

Цель занятия: ознакомиться с планировкой и оборудовани­ем вирусологической лаборатории, ее документацией, правилами и техникой безопасности при работе с вируссодержащим материа­лом.

Оборудование и материалы: помещение вирусологической лаборатории, подготовленное в соответствии с установленными правилами и нормами, электронный и люминесцентный микро­скопы, центрифуги, журнал регистрации студентов, получивших инструктаж по технике безопасности при работе в вирусологиче­ской лаборатории, документация лаборатории.

Краткие теоретические сведения

Вирусологическая лаборатория используется для проведения лабораторных диагностических исследований на вирусные инфек­ции, контроля состояния и напряженности специфического постинфекционного и поствакцинального про­тивовирусного иммунитета, и участия в профилактических мероприятий с вирусными заболева­ниями.

Структура вирусологической лаборатории зависит от задач и особенносте её деятельности. Как правило, вирусологические лаборатории, независимо от специализации, должны размещаться в чистых светлых помеще­ниях с необходимым оборудованием и мебелью. Их следует изо­лировать от других лабораторий (бактериологических, токсикологическтх и др). Независимо от характера выполняемой работы в них необходимо поддерживать рабочую чистоту. Кроме еже­дневной обычной уборки, помещения периодически обрабатывают растворами дезинфицирующих веществ (карболовой кислоты, ли­зола, хлорной извести, хлорамина и т.п.) и подвергают ультра­фиолетовому облучению. Комнаты, предназначенные для работы с вирусами, должны быть хорошо освещены и состоять из двух от­делений, разобщенных стеклянной перегородкой: предбоксника и бокса. В боксах, организованных по типу операционных, над ра­бочим столом, покрытым пластиком или нержавеющей сталью, на расстоянии 50-70 см от поверхности устанавли­вают бактерицидные лампы БУВ-30 или БУВ-60 для уничтожения инфекционных агентов. Дополнительно в боксе желательно иметь пере­движную кварцевую лампу типа ПРК-4. У входа в бокс должен лежать коврик, пропитанный дезраствором. В предбокснике в биксах должны быть сменные тапочки или сменная обувь, стерильные халаты, шапочки, маски, которые одевают перед работой.

Боксы и предбоксники, кроме ежедневной влажной дезин­фекционной обработки, необходимо облучать бактерицидными лампами в течение 30-40 мин перед началом и после работы.. В предбокснике должны быть стерильные халаты, тапоч­ки, маски, которые надевают перед работой, а так же можно размещать дополнительное оборудование.: термостаты, холодильники, центрифуги лабораторные, микроскопы, водяную баню и пр.

В боксе, кроме рабочих столов и стульев, должно быть все необходимое для работы: стерилизаторы для инструментов, банки с дезрастворами для отработанных пипеток, бак с дезраствором для сбора отработанных материалов, баночки со спиртом, йодом, штативы для пробирок, пробирки с бульоном для проверки бактериального загрязнения, стерильные пипетки, ступки и т.д.

Потолок и стены лабораторных комнат покрывают масля­ной краской (стены на 1,5 м от пола можно выложить кафельны­ми плитками), пол — линолеумом или кафельными плитками. Лаборатория должна иметь 5-6 комнат, отдельный вход для сотрудников и для посетителей с тамбуром, обязателен гардероб и душевая.

Регистрация поступающего на исследование патологи­ческого материала проводят в приемной. Пол в ней должен быть бетонный, стены покрыты масляной краской или керамиче­ской плиткой, окна заделаны железными решетками. При входе необходимо положить коврик с дезинфи­цирующим раствором. В приемной размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, бак с дезинфицирующим раство­ром (чаще всего с 3% раствором хлорамина или 5%-ным раствором фенола).

В комнате для предварительной обработки материала прово­дят вскрытие трупов и отбор материала для дальнейшего иссле­дования. В ней должны быть бокс с предбоксником, соединенный окном с виварием для инфицированных животных. В боксе раз­бирают поступившие пробы, готовят и фиксируют мазки — отпе­чатки и т.д. В комнате также должны быть столы для вскрытия трупов и обработки материала. На столе для вскрытия трупов по­мещают инструментарий (ножницы, пинцеты, скальпели, корн­цанги), эмалированный тазик, сосуды с дезинфицирующими рас­творами, стерильную посуду для сбора материала.

Комнату для вирусологических исследований оборудуют: термостатами, холодильниками, центрифугами, весами различных типов, электроплитками, фильтрами, насосами, водяными банями, электромагнитными мешалками и т д.. Лабораторию снабжают в достаточном количестве биксами, фильтрами Зейтца, ящиками для хранения сред, эмали­рованной и стеклянной посудой — матрацами, флаконами, кол­бами разных объемов, градуированными пипетками, микропипет­ками; цилиндрами и стаканами, пробирками серологическими, бактериологическими и центрифужными, ампулами и резиновы­ми пробками разных размеров, металлическими штативами для пробирок, карандашами по стеклу, фильтровальной бумагой, лей­копластырем и т.п.

На столах для определенных операций за каждым работаю­щим закрепляют рабочее место. Здесь размещают нужную аппа­ратуру, соответствующие дезинфицирующие средства, краски, реактивы. На операционном столе необходимы микроскоп, набор инструментов (пинцеты, ножницы, скальпели и др.), вата, пасте­ровские пипетки, стерильные и обезжиренные покровные и пред­метные стекла, физраствор. При работе с куриными эмбрионами должны быть подставки для яиц, овоскопы, инструменты для вскрытия (ножницы, глазные пинцеты).

В автоклавной необхо­димо иметь два автоклава, для чистых материалов – где стерилизуют посуду, питательные среды, инструменты, обезвреживают заразный материал - и для инфици­рованных, бак для сбора инфицированного материала. Допускается наличие сушильных шкафов, дистилляторов, столов и шкафов для стерильной посуды.

Моечная предназначена для мытья посуды и приборов. В ней должна быть машина для посуды и белья, су­шильные шкафы и т.д. Посуду, пипетки и инструменты, загряз­ненные инфицированным материалом, моют только после стери­лизации.

Виварием называется помещение, используемое для выращивания и содержания лабораторных животных. В виварии имеется карантинное отделение, комнаты для экспериментальных и здоровых животных, мытья и дезин­фекции клеток, инвентаря и спецодежды, кухня для приготовле­ния пищи, кладовая, фуражная, трупосжигательная печь и др. Все помещения вивария должны быть изолированы друг от друга и иметь самостоятельные входы с дезковриками. Кроме того, они должны быть непроницаемыми для грызунов и различных насе­комых. Виварий должен быть теплым, светлым (с источником дневного света) и сухим. В холодное время года здесь поддержи­вают температуру 12-20 °С.

Лабораторных животных содержат в клетках. В одной клетке может быть 1-2 кролика, 5-6 морских свинок, 8-10 крыс, 15-20 мышей. На каждой клетке с животными вывешивают пас­порт, где отмечают дату их поступления в виварий, массу, в пас­порте на клетках с подопытными животными дополнительно от­мечают дату заражения и вид вируссодержащего материала.

Чистку клеток и вивария делают ежедневно, используя мыльно-карболовый раствор. После уборки тщательно моют руки и обрабатывают их 2%-ным раствором хлорамина.

Сотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблю­дать следующие правила, предупреждающие попадание бактерий и плесневых грибов в исследуемый материал и возможность внутрилабораторных заражений персонале и распространения инфек­ции.

1. Работать разрешается в специальной одежде — халате и шапочке. При работе с особо опасным материалом дополнительно одевают резиновые перчатки, марлевую маску и защитные очки. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, при необ­ходимости надевают резиновые перчатки и очки. Обязательно ме­няют обувь. В виварии во время мытья посуды и уборки на халат надевают передники, а на ноги — резиновые сапоги.

2. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнюю одежду на халат.

3. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

4. Не допускаются хождение, разговоры во время работы.

5. Весь материал, поступающий в лабораторию на анализ, должен рассматриваться как инфицированный.

6. При распаковке материала необходимо соблюдать осто­рожность. Банки следует обтирать снаружи дезинфицирующим раствором и старить их на подносы или кюветы.

7. Переливание жидкостей, содержащих вирусы, производят над сосудом, наполненным дезраствором.

8. В случае попадания заразного материала на халат, руки, стол, обувь и т.д. надо сообщить об этом заведующему лаборато­рией (в учебных заведениях — преподавателю) и немедленно про­извести под его контролем дезинфекцию. При подозрении на за­ражение необходимо обратиться к врачу.

9. Зараженный материал подлежит обязательному уничто­жению (автоклавирование, сжигание), по возможности в тот же день. Инструменты, а также поверхность рабочего стола после работы сразу же дезинфицируют.

10. При работе с пипетками для разлива жидкого инфици­рованного материала пользуются резиновыми баллончиками (грушами) небольшого объема.

11. В журнале регистрации ежедневно делают записи отно­сительно использованного заразного материала и его уничтоже­ния.

12. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвентарь, материалы и т.д. без предварительной дезинфекции их на месте.

13. Пипетки, предметные и покровные стекла и другую по­суду, бывшую в употреблении, обеззараживают, погружая в 5%-ный раствор лизола, фенола или серной кислоты, которые всегда должны быть на столах.

14. Запрещается оставлять на рабочих столах бактериологи­ческие чашки, пробирки и другую посуду с заразным материалом.

15. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и тщательно дезинфицируют. Вируссодержащий материал, необ­ходимый для дальнейшей работы, ставят на хранение в сейф-холодильник и опечатывают. Руки тщательно дезинфицируют мыльным спиртом, 70°-ным спиртом и др. Лабораторию закры­вают и опечатывают.

Для всех вирусологических лабораторий установлен единый порядок обращения с вирусами, предусматривающий правила их хранения, регистрации, передачи от одного сотрудника другому внутри лаборатории и за ее пределы.

Культуру вирусов хранят в холодильнике минус (20... 70 °С) под замком с пломбой или печатью. Все пробирки и пенициллиновые флаконы, закрытые резиновыми пробками, должны иметь эти­кетки из лейкопластыря с указанием вида вирусов, индивидуаль­ного номера штамма и стабилизирующей среды, в которой он на­ходится. Лучшим способом сохранения вирусов является лиофилизация.

В вирусологической лаборатории должна быть следующая документация.

1. Инвентарная книга музейных штаммов вирусов.

2. Журнал учета движения вируссодержащего материала в лаборатории.

3. Журнал учета стерилизации и уничтожения инфициро­ванного материала.

4. Журнал учета зараженных подопытных животных.

5. Журнал вирусологических исследований (экспертиз).

6. Журнал учета выделяемых вирусов.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с вирусологической лабораторией кафедры и ее основным оборудованием.

2. Изучить правила работы с вируссодержащим материалом.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Объяснение преподавателя.

2. Запись в тетради требований при работе с вирусным ма­териалом и основных правил выполнения этих требований.

3. Роспись в журнале по технике безопасности.

4. Демонстрация: а) лаборатории и ее основного оборудова­ния;

б) организации рабочего места в боксе при работе с вируса­ми..

5. Самостоятельная работа студентов.

6. Подведение итогов.

7. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Занятие можно организовать следующим образом. После объяснения преподавателя и демонстрации (см. п. 4 занятий) сту­денты должны подготовить рабочее место для работы с вирусным материалом. Для этого они проводят его дезинфекцию раствором хлорамина, ставят на стол сосуд с 2%-ным дезраствором, контей­нер для отходов, спиртовку, баночку со стерильной ватой, готовят инструменты (шприц, иглы, пинцет) для стерилизации. Отраба­тывают приемы работы с пипеткой и грушей.

Для ознакомления с документацией лаборатории можно ис­пользовать ветеринарное законодательство, инструкции о прави­лах работы в лабораториях.