АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения

При работе с вирусами постоянно возникает необходимость определения его количества в том или ином материале. Без этого невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство вакцин и диагностических препаратов, оценка активности противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и др.

Титр вируса — это количество вирусных частиц в единице объема материала. Однако, количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объем, масса), поэтом прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности (инфекционные единицы). В практике нашли применение два типа единиц количества вируса: 1) инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемые вирусами и оцениваемые по единичному эффекту; 2) инфекционные единиц 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты.

Определение титра вируса по инфекционным единицам локальных повреждений. Из локальных повреждений, вызываемы вирусами, известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины — некротические узелки на ХАО куриных эмбрионов. В этих случаях говорят о бляшкообразующих единицах (БОЕ) и оспинообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку, а одна ООЕ — одну оспину.

Методика определения сводится к следующему. Точными объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов в ХАО. Затем подсчитывают количество бляшек в каждом матрасе и количество оспин в каждом курином эмбрионе. Рассчитывают среднее арифметическое. Оно точно равно количеству БОЕ или ООЕ вируса. Поскольку объем заражающей дозы точно известен, нетрудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на еди­ницу объема вируссодержащего материала. Это и будет титром вируса в материале.

Например, вируссодержащим материалом в разведении 10^-3 заразили 5 эмбрионов и получили 10, 13, 6, 9 и 10 оспин. Сред­нее арифметическое суммы составит 9,6. Титр вируса в ООЕ оп­ределяют по формуле:

а 9,6

Т= --------- = ------------- = 48 000 ООЕ / 0,2 мл

V n 0,2 х 10^-3

где а— среднее количество подсчитанных оспин; V— объем ви­руссодержащего материала, использованного для заражения; п — степень разведения вируссодержащего материала. Следовательно, исходя из наших расчетов, в 0,2 мл вируссодержащего материала в разведении 10^-3 содержится 48000 ООЕ.

Этот пример титрования вирусов является упрощенным, так как он не учитывает случаев высокой концентрации вируса в ма­териале, при которой бляшки или оспины могут сливаться между собой, и их невозможно будет сосчитать. Обычно счету поддаются бляшки и оспины, количество которых не превышает 50 на матрас или ХАО. Поскольку титр вируса в исследуемом материале обычно не известен (он подлежит определению),то неизвестно, в каком разведении надо брать материал для заражения, чтобы избежать слияния бляшек или оспин.

В этом случае готовят десятикратные разведения вируссо­держащего материала (10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д.) и каждым разведением заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов Подсчитывают количество бляшек или оспин, рассчитывают среднее арифметическое. Титр вируса находят, по формуле:

a₁ + a₂ + … +a_n

T = ------------------------------------

V (n₁ + n₂ + … + n_n)

Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные об их концентрации, но могут возникнуть технические трудности, связанные с получением и подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование для титрования ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.

Определение титра по инфекционным единицам 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты. Наиболее универсальным является метод определения титра вируса в единицах 50%-го инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимают такую его дозу, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных объектов. Она обозначается как ЭД₅₀— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вирусов в единице объема материала и есть его титр в данном материале.

Но, в зависимости от вида объекта и характера его поражения, название эффективной дозы может изменяться. Если виру вызывает гибель зараженных лабораторных животных, титр обозначают символом ЛД₅₀ (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Если же вирус вызывает только определенные признаки болезни, титр обозначают ИД₅₀ (инфекционная доза для 50% зараженных животных). При титровании в куриных эмбрионах и гибели их титр обозначают как ЭЛД₅₀ (эмбриональная летальная доза); при учете лишь патологоанатомических изменений в курином эмбрионе — ЭИД₅₀ (эмбрион-инфицирующая доза); в случае проявления ЦПД в культуре клеток — ТЦД₅₀ (тканевая цитопатическая доза).

Титр вируса выражают в количестве инфекционных доз приходящихся на единицу объема. Например, 10^3.48 ТЦД_50/0.2мл; 10^4.5 ЕИД_50/0.2мл; 10^7.45 ЛД_50/0.2 мл.

Титрование вирусов по 50%-му инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный практически для любого вируса, если подобрать к нему живую систему (тест-объект). Однако, этот метод довольно трудоемкий, длительный и требую статистических расчетов. В настоящем практикуме мы приводим два метода титрования вирусов по 50%-му эффекту.

1. Метод Рида и Менча основан на принципе кумуляции (накопления). Предполагается, что если чувствительные объекты погибают после заражения небольшими дозами вируса, они обязательно погибнут и при введении им более концентрированных и наоборот, объекты, остающиеся в живых после введения вируссодержащего материала в небольшом разведении, не погибнут, если их заразить этим же материалом в максимальном разведении. Принцип кумуляции позволяет искусственно увеличивать число исследуемых объектов и тем самым повысить точность эксперимента.

При определении титра вируса по Риду и Менчу поступают следующим образом. Из исследуемой суспензии готовят ряд последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала (10^-1, 10^-2, 10^-3,..., 10^-10). Делают это по двум причинам: а) удобство в расчетах; б) инфекционное действие вируса убывает прямо пропорционально его разведению. Вируссодержащим материалом в каждом разведении заражают группу чувстви­тельных объектов (в каждой группе не менее 4-6) с целью удобст­ва статистической обработки. За зараженными объектами устанавливают регулярное (не реже одного раза в сутки) наблю­дение и фиксируют результат. Изменения в первые 48 ч после заражения трудно признать результатом действия вируса, особен­но в высоком разведении, их считают неспецифическими и в рас­чет не принимают.

В табл.5 представлена схема титрования вируса. Вируссо­держащий материал использован в 8 разведениях, каждым разве­дением заражено 4 животных (доза 0,2 мл).

При заражений вируссодержащим материалом в разведении 10^-7 не наблюдалось гибели животных, следовательно, леталь­ность здесь равна 0, и выживших мышей будет 4. Но к ним надо прибавить животных, оставшихся живыми после введения вирус­содержащего материала в разведениях 10^-6, 10^-5 и т.д. Таким образом, кумулятивное число выживших животных при зараже­нии вируссодержащим материалом в разведении 10^-7 окажется равным 12. Активностью вируссодержащего материала в разведе­нии 10^-8 пренебрегаем, так как эффект в данном случае аналогичен таковому при исследовании вируссодержащего мате­риала в разведении 10^-7.

Рассуждая подобным образом, находим значение кумуля­тивной летальности. Оно составляет при разведении вируссодер­жащего материала 10^-2 12 животных. Показания, полученные при использовании вируссодержащего материала в разведении 10^-1, по той же причине можно во внимание не принимать.

Вируссодержащий материал в разведении, давшем эффект выше 50%, обозначают буквой В, ниже 50% — буквой А, процент летальности соответственно — b и a. Расчет производят по формуле:

где В - доза вируса, дающая эффект более 50%; А — доза вируса, дающая эффект менее 50%; b, а — эффект дозы соответственно В и А, %; d — интервал между двумя соседними дозами.

Таблица 5

Расчет ЛД₅₀ для мышей по методу Рида и Менча

Подставляя в формулу данные таблицы 5 получим:

Таким образом, ЛД₅₀ при указанном способе титрования вируса на мышах равна разведению 10^-4,5. Зная, что вируссодержащий материал использован в объеме 0,2 мл, можно высчитать концентрацию вируса в исходной вирусной суспензии. В 0,2 мл этой суспензии будет содержаться 10^4,5 ЛД₅₀. Значит, титр виру­са будет составлять: Т = 10⁴'⁵ ЛД_50/0,2 мл или 5 • 10⁴'⁵ ЛД_50/1 мл. Найдем абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛЛ₅₀. В расчет принимают цифру 4,5. Число 4 показывает, что

абсолютной цифре должно быть 5 знаков (4 + 1). А антилогарифм цифры 4,50 составляет 3162. Но поскольку в ней только 4 знака значит пятый знак приписывают в виде 0 и получают 31620. Значит, для нашего примера 1 ЛД₅₀ равна разведению ви­руса 1:31620.

2. Метод Кербера. Этот метод считается более простым, не требующим расчета кумулятивных данных, пригоден и в случаях положительного эффекта от неспецифических причин. Но для получения достоверных результатов необходимо, чтобы положи­тельные данные были известны в диапазоне от 0 до 100%.

Рассчитаем ЛД₅₀ для результатов, приведенных в табл.5.

Разведение вируса Выжило Пало

10-¹ 0 4

10-² 0 4

10-³ 1 3

10-⁴ 1 3

10-⁵ 3 1

10-⁶ 3 1

10-⁷ 4 0

10-⁸ 4 0

ЛД₅₀ высчитываем по следующей формуле:

где D — высшее разведение вируса, еще дающее 100%-ный эффект; d — коэффициент разведения; п — количество заражен­ных тест-объектов на каждое разведение; r — количество поло­жительно реагирующих тест-объектов на каждое разведение;

— сумма отношений положительно реагирующих тест-объектов к зараженным для всех разведений, дающих эффект от 0 до 100%.

Подставляем в формулу значения, получим

Следовательно, в 0,2 мл вируса, разведенного 10^-4,5, содержится одна ЛД₅₀ вируса. Далее рассуждаем так же, как и при расчете по Риду и Менчу. Если lg ЛД₅₀ = -4,5, то ЛД₅₀ = 10^-4,5 или 1:10^4,5. Значит, в 0,2 мл вируса, разведенного 1:10^4,5, содержится 1 ЛД₅₀, а в 0,2 мл исходного вируса содержится таких доз больше в 10^4,5 раза, т.е. 10^4,5 ЛД₅₀. Значит, титр вируса в нашей, суспензии Т = 10^4,5 ЛД_50/0,2 мл, или 1 ЛД₅₀ равна разведению вируса 1:31620.

Титры гемаглютинирующих вирусов можно определить РГА.

Титрование антител. При титровании антител иммунных сывороток используют два метода:

1) определение индекса нейтрализации испытуемой сыворотки;

2) определение максимального разведения испытуемой сыворотки, которое нейтрализует действие стандартной дозы вируса (см. РЗГА, РН и др. реакции).

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 3622 | Нарушение авторских прав