АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ОБМІН ГЕНЕТИЧНИМ МАТЕРІАЛОМ МІЖ БАКТЕРІЯМИ

Хоча бактерії розмножуються шляхом клітинного поділу, у них спостерігається також своєрідний "статевий процес" перенесення генетичного матеріалу від однієї клітини до іншої. Таке перенесення відбувається під час кон'югації - безпосереднього контакту між клітинами. Залежить кон'югація від присутності в одній із клітин особливої плазміди - F-фактора (фактора фертильності) - яка, як і багато інших плазмід, може існувати автономно, а може вбудовуватись у бактеріальну хромосому шляхом сайт-специфічної рекомбінації. В E. coli існує два "статеві" типи клітин, що позначаються як F+ і F^-, - кон'югація супроводжується перенесенням ДНК від клітини F+ до F^-.

F-фактор містить кілька генів, у тому числі такі, що відповідають за утворення так званих пілів - трубчастих виростів на поверхні клітини. Пілі з'єднуються з рецепторами клітин F^-, і між клітинами двох типів утворюється цитоплазматичний місток (рис. 5.2). Специфічна нуклеаза робить одноланцюговий розріз у ДНК F-фактора, інтактний ланцюг слугує матрицею для добудови З'-кінця, що залишився в місці розрізу, - відбувається реплікація циркулярної ДНК F-фактора за так званим типом кільця, що котиться (такий механізм реплікації використовується також для копіювання ДНК багатьох бактеріофагів). Процес добудови З'-кінця виштовхує 5'-кінцеву одноланцюгову ділянку, яка проникає у клітину F^-, де використовується як матриця для синтезу другого ланцюга ДНК. У результаті клітина F^- перетворюється на F⁺ (рис. 5.З).

Частота кон'югації та подвоєння і перенесення F-фактора є невисокою (~10^-5), якщо F-фактор існує автономно від бактеріальної хромосоми (як на рис. 5.2). Коли F-фактор вбудовується в бактеріальну хромосому, частота зростає до 10^-2-10^-1 - такі штами клітин F+ позначаються як Hfr (high frequency recombination). При кон'югації клітин F^- і Hfr вбудований F-фактор ініціює реплікацію за типом кільця, що котиться, цілої бактеріальної хромосоми (рис. 5.З): у клітині Hfr хромосома відновлюється, у клітину F^- переноситься її копія. Насправді ж ціла хромосома потрапляє до клітини F^- дуже рідко - як правило, відбувається порушення кон'югаційної трубки й розрив хромосоми, котра переноситься, (як видно з рис. 5.З, це не порушує вихідну хромосому у клітині Hfr - там завжди є інтактний ланцюг ДНК, який може бути використаний у ролі матриці для відновлення цілісності дволан-цюгової молекули). Оскільки на початку процесу в клітину F^- потрапляє лише частина F-фактора, а щоб він опинився там повністю, вихідна хромосома має зробити повний "оберт" (рис. 5.3), як правило, клітина F^- не перетворюється на F+ при кон'югації з клітиною Hfr.

Коли в клітині F^- опиняється частина гомологічної ДНК іншої бактерії, починається гомологічна рекомбінація, описана в розділі 1, - обмін ділянками між донорною ДНК і ДНК клітини-реципієнта. Результуюча клітина-реципієнт залишається гаплоїдною - "зайва" ДНК, що не потрапила до хазяйської хромосоми, піддається деградації нуклеа-зами, оскільки вона не є циркулярною. Таким чином, між двома бактеріальними штамами відбувається своєрідне часткове схрещування, яке можна досліджувати за допомогою звичайних методів генетичного аналізу. Розглянемо, наприклад, схрещування Hfr-штаму дикого типу за генами thr+ та leu+ (визначають здатність синтезувати відповідні амінокислоти), який містить також ген чутливості до стрептоміцину Str ^S, із штамом F^-, що має ген стійкості до стрептоміцину Str^R і мутантні гени thr та leu- (ауксотрофний штам, який потребує присутності відповідних амінокислот у поживному середовищі):

З певною частотою в такому схрещуванні утворюються рекомбіна-нтні бактерії дикого типу F^-, thr+ leu+ Str^R, які можна відібрати, вирощуючи культуру на середовищі зі стрептоміцином.

Оскільки перенесення генів із клітини Hfr у F^- відбувається послідовно, починаючи із сайта інтеграції F-фактора (рис. 5.3), можна кар-тувати розміщення генів у бактеріальній хромосомі (у порядку потрапляння їх до клітини F^-). Для цього кон'югацію (після змішування клітин двох типів у рідкому середовищі) зупиняють шляхом струшування пробірки через певні проміжки часу. Це дозволило свого часу отримати детальні генетичні карти бактеріальної хромосоми (відстані на таких картах вимірюють у хвилинах) і довести її циркулярність.

F-фактор, інтегрований до хромосоми, може також вирізатися з неї з утворенням автономної плазміди. Таке вирізання іноді буває неточним: ділянка F-фактора залишається в хромосомі, замінюючись на ділянку хромосоми в складі плазміди. Утворюється так званий F'-фактор, який здатен переносити в інші клітини бактеріальні гени незалежно від бактеріальної хромосоми (явище сексдукціі). Після такого перенесення можна отримати частково диплоїдні клітини - за генами, що перебувають у складі F'-фактора. Між останнім і хромосомою клітини-реципієнта можлива гомологічна рекомбінація, що приводить або до утворення Hfr-клітин і дуплікації генів (одиночний кросинговер - вбудовування F'-фактора у хромосому), або до обміну ділянками між хромосомою та F'-фактором (подвійний кросинговер).

Віруси, що розмножуються в еукаріотичних клітинах, представлені всіма можливими варіантами щодо типу нуклеїнової кислоти, яка є носієм генетичної інформації. Залежно від цього та від шляху реалізації генетичної інформації віруси поділяють на сім класів. Шляхи експресії для шести з них показано на рис. 5.8, сьомий клас поєднує властивості класів І і VL При експресії вірусної спадкової програми врешті-решт синтезується молекула мРНК, що слугує матрицею для синтезу вірусних білків клітинною системою трансляції. Полінуклео-тидний ланцюг мРНК позначають як (+)-ланцюг, він комплементарний (-)-ланцюгу або ДНК, або РНК.
Віруси класу І містять дволанцюгову ДНК і, відповідно, використовують канонічний шлях реалізації спадкової інформації. Більшість із них (аденовіруси, бакуловіруси, віруси герпесу, папіломавіруси людини, вірус мавпи SV-40) застосовують транскрипційний апарат клі-тини-хазяїна для синтезу мРНК, реплікація вірусної ДНК здійснюється у клітинному ядрі. Розмір геному варіює від 5,5 до 150 тис. пар основ. Як і бактеріофаги, ці ДНК-віруси можуть реалізувати лізогенетичний шлях, зберігаючись у геномі клітини-хазяїна. Поксвіруси (варіола,

вакцинія), що також належать до класу І, мають ДНК досить великого розміру (~200 тис. пар основ) і власні ферменти, за допомогою яких здійснюється транскрипція та реплікація вірусної ДНК у цитоплазмі.

Віруси класу ІІ, зокрема парвовіруси, містять одноланцюгову ДНК (~5 тис. нуклеотидів) - у вірусних частинках різних вірусів є або тільки (-)-ланцюг, або один із двох типів ланцюгів. У будь-якому випадку на одноланцюговій ДНК у клітині відбувається синтез іншого ланцюга, після чого дволанцюгова ДНК служить субстратом для транскрипції та реплікації.

РНК-віруси класу ІІІ - реовіруси - використовують дволанцюгову РНК як сховище спадкової інформації. Вірусна частинка містить 10-12 окремих молекул довжиною 1-4 тис. пар основ, а також власні ферменти, що здійснюють у цитоплазмі реплікацію РНК і ампліфікацію (+)-ланцюга як мРНК для синтезу білків.

Віруси класу IV - поліовіруси, пікорнавіруси - мають одноланцюгову РНК (7-10 тис. нуклеотидів), яка є (+)-ланцюгом - РНК безпосередньо кодує вірусні білки й тому інфекційна сама по собі. Вірусна РНК є матрицею для синтезу (-)-ланцюгів, які далі використовуються для синтезу більшої кількості (+)-ланцюгів. На (+)-ланцюзі відбувається синтез єдиного поліпептиду - поліпротеїну, - який потім розрізається на окремі вірусні білки.

РНК вірусів класу V - ортоміксовіруси, зокрема вірус грипу, -є (-)-ланцюгом (~12 тис. нуклеотидів, іноді розділена на окремі фрагменти). Віруси використовують власну РНК-полімеразу для синтезу (+)-ланцюгів мРНК.

Віруси класу V! - ретровіруси, зокрема вірус імунодефіциту людини - містять два ідентичні (+)-ланцюги РНК (5-8 тис. нуклеотидів)

і використовують ДНК як проміжну стадію експресії спадкової інформації (рис. 5.9). У вірусній частинці є також два ферменти: зворотна транскриптаза (РНК-залежна ДНК-полімераза) та інтеграза. Зворотна транскриптаза здійснює в цитоплазмі клітини синтез комплементарного ланцюга ДНК із використанням вірусної РНК як матриці та молекули тРНК як праймера, після чого синтезує другий ланцюг ДНК. Дволанцюгова ДНК, що місить гени інтегрази, зворотної транскрип-тази, білків вірусної оболонки та довгі повтори на кінцях (LTR - long terminal repeats) у комплексі з інтегразою прямує до ядра, де інтеграза здійснює інсерцію цієї ДНК у геном. У такій формі провіруса вірусна ДНК може існувати в геномі досить довго. При активації транскрипції на провірусі клітинною РНК-полімеразою синтезується мРНК (що є одночасно вірусною (+)-РНК), відбувається трансляція та фор-мування вірусних частинок. Як правило, ретровірус не вбиває клітину: ДНК разом із провірусом передається дочірнім клітинам, які знову здатні утворювати вірусні частинки. Зрозуміло також, що завдяки активності ретровірусів є можливим перенесення частини генетичного матеріалу від одного організму до іншого.

Генетичний апарат інфузорій відрізняється унікальною особливістю: у клітині присутні не одне, а два ядра - мікро- та макронуклеус. Перший із них містить диплоїдний набір хромосом (наприклад, у Tetrahymena thermophila п'ять пар хромосом), які є тільки сховищем спадкової інформації - гени мікронуклеуса не експресуються. У мак-ронуклеусі хромосомний набір є багатократно дуплікованим (кілька сотень хромосом), і саме гени макронуклеуса активно експресуються, але при цьому не передаються нащадкам.

При нестатевому розмноженні поділ мікронуклеуса здійснюється шляхом мітозу, а макронуклеуса - шляхом простого поділу, тобто з часом він старіє, і його активність знижується. Тоді між двома клітинами проходить статевий процес: відбувається кон'югація, під час якої макронуклеуси руйнуються, мікронуклеуси розділяються шляхом мейозу, і клітини обмінюються гаплоїдними ядрами - деталі процесу можуть розрізнятися для різних видів, але в результаті утворюються клітини, що мають по одному диплоїдному мікронуклеусу. Негайно після цього здійснюється його мітотичний поділ, і одне з дочірніх ядер перетворюється на макронуклеус.

Під час формування макронуклеуса геном не тільки багатократно дуплікується, а й піддається суттєвим перебудовам. Спочатку в складі ядра-попередника макронуклеуса проходять багатократні раунди реплікації ДНК - політенізація хромосом. Далі видаляються численні елементи послідовності ДНК (IES - internal eliminated sequences), розташовані всередині генів мікронуклеуса (таким чином, гени мікрону-клеуса, що перериваються IES, у принципі не можуть бути експресо-ваними). Після стикування кодуючих послідовностей генів здійснюється фрагментація хромосом на своєрідні мікрохромосоми - кожна має один або кілька генів і теломери на кінцях, які синтезуються те-ломеразою. Під час фрагментації хромосом видаляються також усі міжгенні зони, послідовності, що повторюються, і мобільні елементи -прибирається все беззмістовне "сміття". Загалом видаляється до 90 % геному. Нарешті, мікрохромосоми ампліфікуються в 4-6 раундах реплікації - процес дозрівання макронуклеуса завершується.

Геном макронуклеуса інфузорії Tetrahymena thermophila вже встановлено. Він містить 27 тис. генів - стільки ж, скільки у вищих еукаріотів (навіть трохи більше, ніж у людини). Унаслідок видалення значної частини ДНК загальний розмір геному (гаплоїдного набору) дорівнює 105 млн пар основ (у 30 разів менше, ніж у ссавців), вміст послідовностей, що повторюються становить ~2 %. Цікавою особливістю генетично-го апарату Tetrahymena є те, що кодони UAA та UAG (стоп-кодони для більшості організмів) кодують амінокислоту глутамін: тільки UGA використовується як стоп-кодон.

Незвичайна система функціонування спадкового апарату інфузорій ставить важливе фундаментальне питання: чому в еукаріотичних геномах зберігається велика кількість беззмістовної ДНК? При тому, що загальна структура геному інфузорії практично не відрізняється від такої вищих еукаріотів, реалізується механізм видалення беззмістовних послідовностей при утворенні макронуклеуса. Отже, ці послідовності не потрібні для експресії генетичної інформації. Проте ці "зайві" послідовності, як і в інших еукаріотів, ретельно зберігаються в мікронуклеусі й передаються нащадкам. У чому може полягати адаптивне значення такого збереження, залишається не зовсім зрозумілим. Утім, принаймні одна відповідь на це питання здається очевидною: беззмістовна ДНК є саме тією "обкладинкою", в якій зберігається змістовна ДНК, або своєрідним буфером, що захищає змістовний генетичний матеріал від пошкоджуючих впливів. Адже зовнішні мутагенні фактори імовірніше спрямовані на беззмістовну ДНК через те, що вона становить переважну більшість еукаріотичного геному.

Міжнародна програма "Геном людини" була сформульована на початку 90-х років XX ст. Внаслідок копіткої роботи до початку 2003 р. геном людини повністю секвенований, тобто повністю прочитана послідовність трьох мільярдів пар основ, з яких побудована ДНК всіх 23 пар хромосом людини. Генетична довжина геному людини складає 3000 сМ (сантиморганіда, генетична відстань, яка дорівнює 1 % кросинговеру). Розв'язання програми "Геном людини" сприяло створенню генетичної карти, відтворенню цитогенетичної карти геному і власне секвенсу

Генетична карта передбачає встановлення послідовності розміщення генетичних маркерів з відстанню не більше 1 см вздовж усіх хромосом. Така генетична карта дозволяє картувати будь-який ген, встановити відносну відстань між локусами.

Винятковим успіхом програми "Геном людини" було створення інтегральних (фізичних) карт геному.

Картовано близько 40000 кодуючих послідовностей. Загальне число генів, очевидно, складатиме 30500-40000.

На сьогодні весь геном людини клонований у вигляді великих фрагментів, які перекривають один одного. Розташування кожного з цих фрагментів на хромосомі визначено з високою точністю.

Термін клонування означає, що ген картований, виділений, вивчена його структура, знайдена мутація, яка викликає те чи інше захворювання.

Розкриття геному людини сприятиме розвитку нових напрямків медицини, вивченню природи спадкових і злоякісних хвороб, розробці генної і клітинної терапії.

Генна інженерія - галузь молекулярної біології і генетики, завдання якої - конструювання генетичних структур за заздалегідь наміченим планом, створення організмів із новою генетичною програмою. Виникнення генної інженерії стало можливим завдяки синтезу ідей і методів молекулярної біології, генетики, біохімії і мікробіології. Основні принципи генної інженерії були розроблені в 60-70-х роках XX сторіччя. Вони включали три основних етапи: а) отримання генетичного матеріалу (штучний синтез або виділення природних генів); б) включення цих генів у генетичну структуру, яка реплікується автономно (векторну молекулу ДНК), тобто створення рекомбінантної молекули ДНК; в) введення векторної молекули (з включеним у неї геном) у клітину-реципієнта, де вона вмонтовується в хромосомний апарат
Експериментальне перенесення генів в інший геном називається трансгенезом. Він грунтується на технології рекомбінантної ДНК. В основі генної інженерії лежать різні методи маніпуляцій із молекулами ДНК.

Отримання генетичного матеріалу. У сучасній генетиці використовуються два способи синтезу генів поза організмом - хімічний і ферментативний. Для хімічного синтезу необхідно мати повністю розшифровану послідовність нуклеотидів ДНК. Вперше штучний ген синтезував індійський вчений Г. Корана (1970) (рис. 1.69). Це був ген аланінової тРНК дріжджів, який складався з 77 нуклеотидів. У перших дослідах він не виявляв функціональної активності, бо не мав регуляторних ділянок. У 1976 р. вдалося синтезувати ген тирозинової тРНК кишкової палички, який складається не тільки із структурної ділянки (126 нуклеотидних пар), а й регуляторних частин - промотора і термінатора. Цей штучно створений за спеціальною програмою ген був трансплантований у бактеріальну клітину і функціонував як природний.

Іншим прикладом хімічного синтезу є синтез гена, який кодує фермент розщеплення лактози. Синтезований у пробірці ген був вмонтований у плазміду і введений у бактерію; кишкова паличка набула здатності засвоювати лактозу. Проте хімічним шляхом можна синтезувати невеликі за розміром гени прокаріотів. Синтез генів еукаріотів, які складаються з тисячі й більше нуклеотидів, шляхом хімічного синтезу створити поки що не вдалося.

Ферментативний синтез генів здійснюють за допомогою процесу зворотної транскрипції. Відкриття цього процесу зроблено на пухлиноутворювальних РНК-вмісних вірусах. Проте згодом виявилося, що передавання генетичної інформації з іРНК на ДНК може відбуватися в умовах експерименту і з іншими РНК. Саме це лежить в основі ферментативного синтезу гена. Спрощено це можна подати таким чином: у пробірці на матриці ІРНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази (ревертази) синтезується комплементарна до неї нитка ДНК, потім утворюється двониткова молекула ДНК. Після цього іРНК руйнується ферментом рибонуклеазою, отриману ДНК називають ДНК-копією (кДНК). Така кДНК не має вставок-інтронів, тобто схема її будови не відрізняється від бактеріального гена.

Матричну (інформаційну) РНК (мРНК) виділяють із клітин або тканин, в яких експресується потрібний ген. Так, для клонування проінсулінового гена використовують B-клітини підшлункової залози, тому що саме для них характерний високий вміст проінсулінової мРНК.

Ген, отриманий внаслідок ферментативного синтезу, може функціонувати в бактеріальній клітині. На ньому синтезується ІРНК, а потім білок. Під керівництвом В. Енгельгардта був отриманий ген, який визначає синтез ферменту галактозидази. Цей ген вводили у фаг, при розмноженні якого в клітині одержали безліч копій, що забезпечило синтез великої кількості ферменту. Це має не тільки теоретичне, але й практичне значення, тому що галактозидаза застосовується в харчовій промисловості.

Синтезовано гени глобіну людини, кроля, голуба, деякі гени мітохондрій печінки пацюків і багато інших.

Гени, синтезовані за допомогою ревертази, не мають регуляторної частини і промотора. Відсутність регуляторних ділянок перешкоджає функціонуванню цих штучних генів у тваринних клітинах. При перенесенні в мікробну клітину до структурних генів експериментально, за допомогою ферментів, приєднують промотор,який добувають з мікробної клітини. Так були синтезовані два гени, відповідальні за синтез ланцюгів інсуліну. їх вводили в геном кишкової палички, яка почала продукувати інсулін. Важливим досягненням генної інженерії є синтез гена соматостатину, який може функціонувати у мікробній клітині. Таким же методом під керівництвом Ю. О. Овчиннікова і М. П. Дубініна здійснений синтез генів, які кодують нейрогормони людини (лейцин-енкефалін і брадикінін).

Ферментативний синтез генів має велике значення, тому що принципово можливо проводити штучний синтез будь-яких індивідуальних генів шляхом транскрибування їх із відповідних матричних РНК. Основною перешкодою є синтез не структурних, а регуляторних частин генів, необхідних для їх нормальної роботи. Це здебільшого обмежує використання штучно синтезованих генів.

У генній інженерії широко використовують так само і виділення природних генів з метою створення рекомбінативних молекул ДНК.

Включення отриманого гена у вектор.

Вектор - це щось подібне до молекулярного "таксі", здатного переносити чужу ДНК всередину бактеріальної клітини таким чином, щоб вона там змогла реплікуватися. Існує два основних типи векторів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги.

Після виділення або синтезу гена його зшивають з векторною (спрямовуючою) молекулою ДНК. З цією метою використовують особливі бактеріальні ферменти. Такі ферменти є у бактерій, у яких вони зупиняють репродукцію вірусу, вирізаючи вірусну ДНК із геному бактерії. Вони називаються рест- риктазами, оскільки обмежують розмноження вірусів. Кожен тип ферментів рестрикції, а їх відомо близько 100, розділяє ДНК у специфічному місці, що називається сайтом рестрикції (рис. 1.70).

У проміжку, що з'явився, може бути розміщена ділянка чужорідної ДНК. Таку ДНК можна розрізати за допомогою того ж ферменту рестрикції. Одноланцюгові комплементарні кінці двох ДНК називають "липкими кінцями", тому що вони з'єднуються внаслідок комплементарного спарювання азотистих основ. Вони полегшують вставку чужорідної ДНК у векторну.

Таким чином, можна поєднувати відрізки ДНК, отримані з різних джерел, і створювати комбінації генів в одній довгій молекулі. Оскільки водневі зв'язки легко розриваються, для з'єднання ділянок застосовують фермент лігазу - один із ферментів репарації. Комбінуючи різні рестриктази і лігази, можна розрізати нитку ДНК у різних місцях і одержувати рекомбінантні молекули (наприклад, плазмідну ДНК з вмонтованим чужим геном).

Вмонтовування в геном реципієнта.

Векторні молекули, які містять у собі фрагменти чужорідної ДНК, повинні мати властивість, яка забезпечує третій етап генної інженерії - проникнення в клітину-реципієнта і вмонтовування в її геном. Реципієнтні клітини, тобто клітини, обрані для клонування гена, можуть бути як про-, так і еукаріотичними. Найчастіше для цієї мети використовують бактерії, оскільки їх легко одержувати у великих кількостях. Перенесення генів може здійснюватися з однієї бактерії в іншу за допомогою плазмід. Рекомбінантні молекули ДНК відокремлюють від молекул, що містять тільки донорську або тільки плазмідну ДНК. Для їхнього поділу використовується плазміда, що має два гени стійкості до двох визначених антибіотиків. При цьому клітини, що ростуть за наявності двох антибіотиків, містять тільки вихідну плазміду. Клітини, що гинуть під дією двох антибіотиків, позбавлені плазмід і містять тільки донорську ДНК. Клітини, що ростуть за наявності одного антибіотика і гинуть за наявності іншого, - містять рекомбінантну плазміду.

Якщо в плазміду вмонтовані інші гени, вони передаються в клітину-хазяїна шляхом трансдукції і вмонтовуються в її геном (рис. 1.68), де здатні до швидкої реплікації за допомогою ферментативної системи клітини-хазяїна. Цей процес швидкого одержання великої кількості однакових копій називається клонуванням. Клон - це велика популяція ідентичних молекул, бактерій, клітин, організмів, які отримані від одного предка (рис. 1.71).

Клонування генів - це процес, що включає виділення й ампліфікацію (дублювання великої кількості) окремих генів у реципієнтних про- й еукаріотичних клітинах. Ці клітини, які містять потрібний нам ген, можна використовувати для одержання: а) великої кількості білка, що кодується даним геном, або б) великої кількості самого гена у високоочищеному вигляді.

Крім плазмід, як вектор використовуються фаги (фаг лямбда), віруси (мавпячий вірус SV40). У випадку використання фагів і вірусів перенесення генетичного матеріалу здійснюється за допомогою трансдукції. Особливим випадком трансдукції є перенесення чужорідних генів в еукаріотичні клітини за допомогою неонкогенних вірусів і фагів. Вперше припущення, що трансдукція можлива в еукаріотів, було висловлено С. М. Гершензоном у 1966 р. при дослідах на шовковичному шовкопряді.

Рекомбінантна ДНК-технологія має як наукове значення (дозволяє виділити окремий ген складного організму і вивчити його функцію на молекулярному рівні), так і практичне застосування. За допомогою рекомбінантної ДНК-технології можна виробляти різні білки для медичної практики. Такі ліки більш безпечні, ніж аналогічні білки, отримані безпосередньо з організмів. Першим таким рекомбінантним препаратом став інсулін.

Інший важливий напрямок біотехнології - виробництво вакцин. Такі вакцини не можуть викликати хвороб, тому що виготовляються з одного із поверхневих білків. Ген такого білка використовується для біореконструкції бактерії. Так створена вакцина проти гепатиту В. Успішно ведеться робота над вакцинами для гепатитів А, С, хламідіозів, герпесу й інших захворювань.

Трансгенні організми. За допомогою методів генної інженерії можна одержати різні організми, які мають у складі свого геному чужорідні гени інших організмів. Такі організми називаються трансгенними. У даний час ця галузь науки швидкорозвивається.

У різних галузях господарської діяльності людини використовуються трансгенні бактерії. Крім того, що бактерії використовуються для клонування генів і виробництва білка, вони реконструюються і для інших цілей.

Так, біоінженерні бактерії використовуються для оздоровлення рослин. Бактерії, що живуть у рослинах і стимулюють утворення кришталиків льоду, були змінені з холод-плюс на холод-мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рослин від морозу. У бактерій, що утворюють симбіоз з коренями кукурудзи, були введені, гени (від інших бактерій), що кодують токсин для шкідливих комах.

У природі існують бактерії, що можуть розщепити будь-яку органічну речовину. Бактерії відбираються за здатністю розщеплювати певну речовину, а згодом ця здатність підсилюється внаслідок біотехнології. Таким шляхом були створені бактерії, які поїдають нафту, що розлилася внаслідок техногенних катастроф.

Бактерії використовують для бактеріального синтезу. Так, були реконструйовані бактерії для виробництва амінокислоти фенілаланіну.

Широке використання рекомбінантних бактерій у сільському господарстві, промисловості, захисті навколишнього середовища обмежувалося побоюванням того, що такі бактерії можуть замінити природні мікроорганізми в екосистемах з виникненням несприятливих наслідків. На даний час розроблено методи визначення, виміру і навіть блокування діяльності цих клітин у навколишньому середовищі.

Зручним об'єктом для генетичних маніпуляцій виявилися рослини, тому що рослинні клітини можна вирощувати в культурі, де із кожної клітини отримують цілу рослину.

Ведуться роботи зі створення біоінженерних рослин, що могли б мати наступні властивості: 1) високу пристосованість до умов зовнішнього середовища; 2) містити більшу кількість необхідних для людини поживних речовин; 3) тривалий час зберігатися без псування.

Розробляються трансгенні рослини, здатні продукувати в інтересах людини хімічні речовини й ліки. Реконструйовано картоплю для продукції альбуміну людини. Передбачається, що в майбутньому рослини зможуть утворювати у своїх насіннях такі білки, як гормони людини.

Швидкими темпами розвивається біоінженерія тварин. Яйцеклітину поміщають у спеціальну мішалку разом з чужорідною ДНК і дрібними силікон-карбідними голками. Голки роблять множинні отвори в оболонці, крізь які ДНК попадає в клітину. За допомогою цієї технології бичачий гормон росту був введений у яйцеклітини багатьох видів тварин. Завдяки цій технології отримані великі риби, корови, свині, кролики, вівці. Трансгенні тварини створені для виробництва продуктів медичного значення.

Ланцюговим інструментом для генетичних досліджень стали трансгенні миші (рис. 1.72). Вони дають важливу інформацію при плануванні генної терапії у людини. Вчені, що вивчають м'язову дистрофію Дюшена, виділили ген і його продукт - нормальний білок дистрофін, що відсутній у хворих. Запропоновано спосіб забезпечення хворих дітей дистрофіном. Але що буде, якщо дистрофін потрапить в інші тканини, або його буде утворюватися занадто багато? Для вирішення цих питань були створені трансгенні миші, у м'язах яких міститься дистрофіну в 50 разів більше, а також відбувається продукція цього білка в інших тканинах. Дистрофін не викликає у таких мишей патологічних відхилень.
Трансгенні миші виявилися вкрай необхідними при вивченні моногенних хвороб, злоякісних пухлин і навіть мультифакторіальних хвороб людини.

Проте трансгенна технологія є неточною, тому що введення ДНК не спрямоване у визначений локус хромосоми. Ген, що переноситься, може порушити функцію іншого гена або потрапити під контроль інших генів. Навіть якщо трансген вставляється в хромосому й експресується, його ефект може бути перекритий таким же геном клітини-хазяїна. Тому була розроблена технологія більш точного "націлювання" гена(gene targeting), при якій ген, що вводиться, займає місце свого двійника у хромосомі клітини-хазяїна. При цьому використовується природний процес гомологічної рекомбінації. Внаслідок такої технології заміняють інактивованим геном активний ген у мишей і простежують ефект його відсутності навіть в ембріона. Так вивчають функцію білків імунної системи, механізм взаємодії онкогенів у виникненні пухлини, розвиток генетичних захворювань.

"Націлювання" гена - складна методологія, вона не працює у заплідненій яйцеклітині ссавців. Ген можна впровадити тільки в клітини на ранніх етапах розвитку зародка, до його імплантації у стінку матки. Клітини такого зародка тотипотентні і багато генів у них ще не експресовані.

"Націлювання" гена має велике значення при створенні моделей генетичної патології у тварин. Важливо те, що вчені ідентифікують версію людського апеля, який викликає хворобу у тварин. Потім відповідний людський мутантний алель переноситься в ембріональні стовбурові клітини і, нарешті, схрещують тварин, гомозиготних за інактивованим геном.

Тварин з "виключеним" геном використовують у вивченні складних хвороб, у які задіяно багато генів. Так, наприклад, вивчають атеросклероз шляхом інактивації сполучення генів, продукти яких контролюють ліпідний метаболізм.

Геном миші. Розшифровка геному людини в лютому 2001 року не дала відповіді на всі питання антропогенетики. Незважаючи на секвенування геному і визначення приблизної кількості генів, що кодують білки, функція більшості з них залишається невідомою. На даний час не ідентифіковано всі гени, що відповідають за розвиток спадкових хвороб і хвороб зі спадковою схильністю.

Розшифровка геному миші, яку використовували в лабораторних дослідженнях з 1900 р., у грудні 2002 року дала нові можливості для вивчення геному людини.

Кількість генів миші складає 27000-30500, що приблизно відповідає кількості генів людини. Близько 99 % цих генів мають нуклеотидну послідовність, властиву людському геному і-96 % із них знаходяться в "синтенних" ділянках хромосом миші і людини.

На даний час можливе виведення трансгенних мишей з точним "вимиканням" (делецією) генів, тіроводити аналіз змін фенотипу, що виникають внаслідок цього, і згодом шукати подібні нуклеотидні послідовності в геномі людини. Це прискорить ідентифікацію генів, що відповідають за розвиток певних нормальних і патологічних ознак у людини.

Аналіз нуклеотидної послідовності миші дозволить точно "націлювати" гени людини у схожі нуклеотидні послідовності миші і створювати "людські" ознаки у лабораторних трансгенних мишах. Наприклад, включені в геном миші людські гени білків цитохромів, що беруть участь у метаболізмі ліків, дозволять точно моделювати дію ліків.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 718 | Нарушение авторских прав