АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Моноклонального реагента анти-D

Действующим началом реагента анти-D являются моноклональные человеческие анти-D антитела, которые продуцируются гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии и миеломной клеточной линии мыши.

Моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса М, являются полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих D-антиген.

В связи с тем, что IgМ антитела не вызывают агглютинации некоторых образцов эритроцитов со слабовыраженным D-антигеном (D^u), определение резус-принадлежности реципиентов и доноров отличаются. Реципиенты с группой крови D^u рассматриваются как резус-отрицательные и определение их резус-принадлежности ограничивается только тестированием моноклональным реагентом анти-D.

Доноры, содержащие D^u антиген, рассматриваются как резус-положительные и определение их резус-принадлежности идет в два этапа.

Образцы донорской крови, которые при исследовании реагентом анти-D были определены как D-отрицательные, необходимо дополнительно исследовать с помощью других анти-D реагентов, содержащих неполные антитела класса IgG: поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D IgG реагентом на присутствие D^u антигена (таблица 2).

Таблица 2

Трактовка результатов определения

резус-принадлежности реципиентов и доноров

Определение D-антигена системы Резус

реакцией агглютинации на плоскости

На пластинку со смачиваемой поверхностью нанести большую каплю (0,1мл) реагента. Рядом поместить маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешать кровь с реагентом. Четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 секунд. Результат реакции учитывается через 5 минут.

Определение D-антигена системы Резус

реакцией агглютинации в пробирках

В круглодонную пробирку внести 1 каплю (около 0,1 мл) реагента и добавить 1 каплю 5%-ой суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки тщательно перемешать встряхиванием. Инкубировать пробирки при комнатной температуре 30 минут. После инкубации пробирку центрифугировать при 1500-2000 об/мин. в течение 1 минуты. Мягко покачивая пробирку отслоить осадок от дна. При отрицательном результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.

Определение D-антигена системы Резус

реакцией агглютинации в микроплате

В лунку 96-ячеечной микроплаты внести 0,05 мл реагента и 0,05 мл 2%-ой суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды отмываются). Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре визуально оценить результат реакции по рисунку осадка эритроцитов: при отрицательном результате осадок эритроцитов собирается в точку, при положительном – имеет большой диаметр, располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые края.

Контроль специфичности

Для контроля специфичности реакции необходимо включать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.

6. Определение резус-принадлежности в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса) с помощью неполных анти- D антител

Параллельно с исследованием образцов тестируемой крови проводят контрольное исследование со стандартными резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами.

Техника определения

Из исследуемой крови готовят 2-5%-ую взвесь отмытых эритроцитов. С этой целью:

вносят в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, трижды отмытой в 5-10 мл физиологического раствора;

ресуспендируют осадок эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, что предпочтительнее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы – LISS (в этом случае произойдет более прочная и быстрая фиксация антител на эритроцитах);

маркируют чистую пробирку;

вносят в нее 1 каплю реагента анти-D;

добавляют 1 каплю 2-5%-ой взвеси исследуемых эритроцитов;

если эритроциты суспендированы в физиологическом растворе, то инкубируют смесь при 37°С в течение 45 минут; если используются эритроциты в LISS, то 10-15 минут;

трехкратно отмывают эритроциты в 5-10 мл физиологического раствора;

удаляют физиологический раствор;

добавляют 1 каплю антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешивают;

центрифугируют 15-20 секунд при 2000-3000 об/мин (900-1000g);

аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации. При наличии агглютинации кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинации – резус-отрицательной. Слабая агглютинация возможна при экспрессии антигена D^u;

записывают результаты исследования.

В настоящее время для определения резус-принадлежности эритроцитов используются также идентификационные карты для определения групп крови АВ0 и резус-принадлежности в гелевом тесте (ID-карты «ДиаМед» и других производителей), метод с использованием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами («Biotest» и других производителей), микропланшеты Эритайп с нанесенными моноклональными антисыворотками (компании «Biotest AG», Германия и других производителей), карты универсальные серологические (с микроколонками) Сэллбайнд (компании «Sanquin Reagents», Голландия и других производителей).

Техника проведения исследования резус-принадлежности с использованием этих методов приводится в инструкции «Определение групп крови системы АВ0 при помощи изогемагглютинирующих сывороток», а такжесиспользованием подробной инструкции производителя.

III. ПЕРЕЧЕНЬ ВОЗМОЖНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ИЛИ

ОШИБОК ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ И ПУТИ ИХ УСТРАНЕНИЯ

1. При определении резус-принадлежности, независимо от метода определения, результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность каждой серии сыворотки антире­зус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы или группы 0(I) и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы 0(I) и в других контрольных пробах, применяемых для каждого метода.

2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается слабая или сомни­тельная реакция, следует повторно исследовать кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими методами, включая метод агглютина­ции в солевой среде с сыворотками, содержащими полные антитела.

Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные антитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными антителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты содержат слабую разновидность антигена резус, так называемый антиген D ^u, частота которого составляет около 1%. В этих случаях резус-принадлежность крови больного или беременной женщины указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежность крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская, таким образом, перелива­ния его крови резус-отрицательным реципиентам.

IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУС

При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е, анти-С^W в чистом виде, а также в сочетании с анти-D, например D+C, D+E, D+C+E, применяются те же методы, что и при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом учитывается форма антител.

В качестве контролей обязательно используют эритроциты, содержащие и не содержащие соответствующий антиген.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УТВЕРЖДАЮ

Первый заместитель Министра

____________Р.А. Часнойть

13.11.2008 г.

Регистрационный № 114-1108

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОК И УНИВЕРСАЛЬНОГО РЕАГЕНТА АНТИРЕЗУС

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

инструкция по применению

УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК:

Государственное учреждение «Республиканский

научно-практический центр гематологии и

трансфузиологии»

АВТОРЫ:

д.м.н., профессор Потапнев М.П., к.м.н., доцент Свирновская Э.Л.,

Дворина Е.М., Будько Т.В., Полкова Е.В.

Минск, 2008

Стандартные сыворотки антирезус служат для определения резус-принадлежности эритроцитов людей и приготавливаются из донорской крови, содержащей активные резус-антитела, возникшие вследствие сенсибилизации к резус-фактору.

Дата добавления: 2015-11-28 | Просмотры: 755 | Нарушение авторских прав