АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

В регуляции физиологических функций принимают участие разнообразные химические факторы, способные обеспечить большое разнообразие способов воздействия на эффекторные клетки (клетки-мишени). Эти химические факторы имеют либо нервную (медиаторы), либо эндокринную (гормоны) природу и в результате взаимодействия с клетками-мишенями вызывают определенные обратимые функциональные или метаболические или структурные перестройки. В целом можно выделить следующие три основных способа воздействия биологически активных веществ (гормонов, нейромедиаторов, токсинов, лекарственных препаратов и других) на клетки-мишени:

ü изменение компартментализации веществ в клетке или клеточном ансамбле, которое преимущественно достигается путем временного изменения проницаемости клеточной мембраны для различных ионов, коферментов или метаболитов и соответственно величины мембранного потенциала или поступления определенных веществ в клетку-мишень

ü усиление или ослабление каталитической активности ферментов, что достигается чаще всего их обратимой модификацией под действием определенных внутриклеточных посредников действия гормонов (цАМФ, цГМФ, кальция, инозитолфосфата, диацилглицерола)

ü изменение концентрации определенных ферментов или структурных белков в клетке-мишени в результате регулирующего влияния гормонов на их синтез или деградацию.

Регуляция биологически активными веществами поступления в клетку ионов, метаболитов, кофакторов и других веществ. Такой способ регуляции функциональной активности клеток-мишеней типичен для медиаторов, которые приспособлены для передачи сигналов от нервной клетке к другому нейрону или клеткам исполнительных органов, и ряда гормонов, действующих через плазматическую мембрану. Передача сигнала в химических синапсах, реализующаяся с участием медиаторов, характеризуется большой быстротой, точным выбросом адресата и многократным усилением медиаторного сигнала на постсинаптическую мембрану. В качестве медиаторов в химических синапсах выступают органические вещества относительно простой химической природы (аминокислоты, пурины или пептиды), которые под действием приходящего к пресинаптическому полюсу нервного импульса высвобождаются и взаимодействуют с постсинаптическими образованиями в считанные доли секунды. Результатом такого взаимодействия является временное изменение ионной проницаемости постсинаптической мембраны и соответственно мембранного потенциала, наступающее вследствие ослабления или усиления транспорта через постсинаптическую мембрану ионов натрия, калия, кальция или хлора. При этом, несмотря на очень короткий период полужизни медиатора и действия его на постсинаптическую структуру, благодаря многократному усилению медиаторного сигнала достигается высокая эффективность работы химических синапсов. Так, в каждой везикуле пресинаптического полюса содержится около 2-4 тыс. молекул ацетилхолина. При выделении в синаптическую щель содержимого всего лишь одной везикулы открываются на доли миллисекунды около 2·10³ хемовозбудимых натриевых каналов. За этот короткий промежуток нахождения каждого канала в открытом состоянии может переноситься несколько тысяч ионов натрия. Таким образом, на уровне действия медиатора на каждый хемовозбудимый канал постсинаптической мембраны имеет место 1000-кратное усиление медиаторного сигнала. Высвобождение одного кванта медиатора в синаптическую щель приводит к сдвигу потенциала постсинаптической мембраны всего лишь на 0,5 мВ. Благодаря же генерализованному относительно синхронному высвобождению большого количества везикул с медиатором (около 200-300) в синаптическую щель под влиянием приходящего к пресинапсу нервного импульса, потенциал постсинпатической мембраны может сдвинуться на 20 мВ, что является достаточным для инициации потенциала действия во внесинаптической мембране иннервируемой структуры. Так, при активации синапса приходящим к пресинапсу нервным импульсом в синаптическую щель выбрасывается (3-5)·10⁶ молекул ацетилхолина. Это количество молекул ацетилхолина, связываясь с рецепторами постсинаптической мембраны, открывает около 6·10⁵ хемовозбудимых натриевых каналов, что обуславливает перенос через постсинаптическую мембрану около 6·10⁸ ионов натрия. При этом во внесинаптической мембране открываются потенциалзависимые каналы, способные пропускать каждый за 1 мс 10⁵ ионов натрия и 300 ионов кальция, вследствие чего проводимость внесинаптической мембраны для натрия возрастает в 100 раз, что обуславливает ее быструю обратимую перезарядку (генерацию потенциала действия). Перезарядка внесинаптической мембраны активирует электровозбудимые калиевые каналы, что способствует постепенному возврату мембранного потенциала к исходному уровню. Быстрота реакции постсинаптической мембраны на ацетилхолин и высокая ее чувствительность к медиатору, отчасти обуславливающая возможность усиления медиаторного сигнала, определяется также тем, что на сравнительно маленькой площади постсинаптической мембраны сконцентрировано огромное количество холинорецепторов (10⁴-10⁵ молекул на 1 мкм²). Большую роль в обеспечении дискретной работы синапса играет фермент холинэстераза, концентрация молекул которой приблизительно равна концентрации холинорецепторов. В течение 1 мс холинэстераза полностью освобождает синаптическую щель от ацетилхолина, подготавливая синапс к восприятию и проведению следующего импульса.

Гормоны, в отличие от медиаторов, как правило, оказывают более сложное, медленнее реализующееся и более длительное влияние на клетки-мишени, отличающиеся от постсинаптических структур большим количеством и разной пространственной ориентацией. Вместе с тем, одни и те же вещества (например, катехоламины, серотонин, нейропептиды) могут выступать и в роли гормонов и в роли нейромедиаторов, в результате чего функции гормонов и медиаторов переплетаются и становятся неразличимыми или взаимозаменяемыми в их влиянии на клеточные эффекторные системы. Более того, гормоны могут модулировать эффект медиатора на постстинаптическую мембрану путем регуляции высвобождения медиатора или реализации его эффекта. Белково-пептидные гормоны и катехоламины, подобно нейромедиаторам, действуют через рецепторы, расположенные на поверхности клетки (мембранные рецепторы), и в результате такого действия также способны изменять пассивный или активный ионный транспорт (в случае, если способны регулировать активность АТФаз). Так, для ряда медиаторов и гормонов мембранные рецепторы сопряжены с натриевыми или кальциевыми каналами. При этом вместе с ионами в клетку одновременно могут входить аминокислоты, или глюкоза, или жирные кислоты, что определяет механизм действия многих гормональных веществ. В частности, катехоламины, действуя через a₁-адренорецепторы, способны изменять проницаемость мембран клеток-мишеней для кальция или натрия, а, действуя через a₂ – для ионов калия. Ангиотензин и простагландины F повышают вход кальция в клетки-мишени, инсулин и соматомедины регулируют поступление в клетки-мишени глюкозы и аминокислот.

Наряду с гормонами, действующими только через мембранные рецепторы, в регуляции проницаемости мембран клеток-мишеней могут принимать участие и гормоны, способные проникать внутрь клетки (некоторые стероидные и тиреоидные гормоны). При этом действие стероидных и тиреоидных гормонов на проницаемость биологических мембран может реализоваться двумя путями. Во-первых, они способны, действуя через мембранные рецепторы и вторичные посредники, оказывать влияние на состояние ионных каналов и ионных насосов. В частности, в некоторых клетках-мишенях для тиреодных гормонов, в том числе и не имеющих ядра, (эритроцитах, скелетных и сердечных мышечных волокнах, нервных клетках) установлено непосредственное активирующее влияние тиреоидных гормонов на потенциалзависимые натриевые или кальциевые каналы и на Na⁺/К⁺-насос или Са²⁺-насос. Глюкокортикоиды, подобно тиреоидным гормонам, также обладают способностью усиливать пассивный транспорт натрия или кальция через электровозбудимые каналы в некоторых возбудимых структурах (в частности, в скелетных мышечных волокнах, сердечных мышечных клетках и нервных клетках). Андрогены способны оказывать активирующее влияние на Na⁺/К⁺-насос в некоторых клетках-мишенях. Во-вторых, стероидные и тиреоидные гормоны, действуя через геном, способны регулировать синтез белков ионных каналов и ионных насосов, а, следовательно, их плотность в мембранах, что, наряду с активирующим влиянием на состояние ионных каналов и насосов, должно также сопровождаться усилением ионного транспорта. Так, в литературе существуют сведения, согласно которым тиреоидные гормоны могут непосредственно стимулировать синтез белков электровозбудимых натриевых и кальциевых каналов и каналов пассивной утечки этих ионов в мембранах некоторых клеток-мишеней (скелетных и сердечных мышечных волокнах, нервных клетках). Кроме того, тиреоидные гормоны в некоторых структурах стимулируют синтез АТФаз ионных насосов (Na⁺/К⁺-насоса или Са²⁺-насоса в плазматической мембране и мембране саркоплазматического ретикулума мышечных волокон). Все отмеченные механизмы действия тиреоидных гормонов на ионный транспорт обуславливают усиление как пассивной, так и активной диффузии ионов через биологические мембраны в определенных клетках мишенях. Альдостерон (самый активный минералокортикоид) повышает проницаемость мембран клеток дистальных отделов канальцев нефрона для ионов натрия путем усиления синтеза белков натриевых каналов в канальцевых клетках (т.е. его влияние на натриевую проницаемость мембран канальцевых клеток реализуется геномным путем). Таким образом, регуляция интенсивности ионного транспорта под влиянием стероидных и тиреоидных гормонов осуществляется как в результате их влияние на активность ионных каналов и насосов, так и путем изменения их плотности в мембранах.

При этом принято считать, что влияние многих нейромедиаторов (например, ацетилхолина, серотонина) и гормон-рецепторных комплексов (образуемых катехоламинами, гистамином, холецистокинин-панкреозимином и т.д.) на проницаемость мембран клеток-мишеней для кальция реализуется через изменение состояния мембранных фосфоинозитидов (т.е инозитолфосфатным путем). В частности, при связывании агониста с рецептором активируется некий мембранный фермент (возможно участвующий в обмене фосфоинизитидов, например, фосфолипаза С), который катализирует образование инозитолтрифосфата, индуцирующего высвобождение кальция из связанного с мембраной состояния, или повышение внутриклеточной концентрации кальция благодаря открыванию кальциевых каналов. Повышение внутриклеточной концентрации кальция приводит к активации гуаналатциклазы и соответственно повышению концентрации цГМФ в клетке-мишени. Кроме того, сам кальций или цГМФ способны вызывать в клетках следующие процессы (в зависимости от типа ткани): сокращение, секрецию, активацию ряда внутриклеточных ферментов (киназа фосфорилазы, протеинкиназы, фосфодиэстераза и других), агрегацию и адгезию клеток, стабилизацию и слияние мембран, активацию митохондриальных процессов (транспорт a-кетоглутарата и адениловых нуклеотидов), деполимеризацию микротрубочек, активацию системы свертывания крови, стимуляцию синтеза ДНК, регуляцию химической и электрической активности мембран, фоторецепцию и т.д.

Мембраннотропные гормоны и нейромедиаторы, изменяющие концентрацию циклических нуклеотидов в клетке, как правило, не оказывают существенного влияния на транспорт метаболитов через биологические мембраны, но способны оказывать регулирующее влияние на активный и пассивный транспорт ионов. Так, цАМФзависмое фосфорилирование определенных белков приводит к повышению активности Nа⁺/К⁺-насоса плазматической мембраны и Са²⁺-насоса мембран саркоплазматического ретикулума. Фосфорилирование мембранных белков может регулировать и вход и выход кальция в клетки-мишени. Так, в тучных клетках цАМФзависимое фосфорилирование мембранных белков препятствует пассивному входу кальция, в миокардиальных клетках – может активировать и вход и выход кальция, а в эритроцитах – вызывает вход кальция в клетку. Более того, эффект цАМФ на трансмембранный транспорт кальция может зависеть от концентрации цАМФ. Так, в сердце при определенных концентрациях цАМФ стимулируется активный транспорт кальция из клетки, при повышении концентрации цАМФ, напротив, ускоряется вход кальция в кардиомиоцит через медленные хемоуправляемые кальциевые каналы.

В ряде случаев цАМФзависимое фосфорилирование немембранных белков может изменять их сродство к ионам кальция, что также повлияет на концентрацию свободного кальция в цитоплазме клетки-мишени. Так, цАМФзависимое фосфорилирование кальмодулина приводит к повышению его сродства к кальцию, что сопровождается, во-первых, увеличением связывания кальция кальмодулином и, как следствие, уменьшением доли свободного кальция в цитоплазме клеток-мишеней, а, во-вторых, активацией кальмодулина, который вызывает активацию фосфодиэстеразы, расщепляющей цАМФ и тем самым ограничивающей и в конечном итоге прекращающей действие цАМФ на клетку. Подобный механизм действия гормонов через мембранные рецепторы, сопровождающейся уменьшением содержания свободного кальция в цитоплазме клеток-мишеней лежит в основе расслабляющего действия катехоламинов на гладкомышечные клетки сосудов и бронхов, реализуемый через β₂-адренорецепторы. Так, катехоламины, действуя через β₂-адренорецепторы, вызывают активацию аденилатциклазы и образование цАМФ, которая активирует протеинкиназу. Протеинкиназа путем фосфорилирования обратимо активирует кальмодулин и некоторые мембравнно связанные белки, которые связывают часть свободного кальция. Уменьшение же концентрации свободного кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток приводит к их расслаблению.

Проницаемость мембран для определенных веществ под действием мембраннотропных гормонов может быть изменена не только вследствие цАМФзависимого фосфорилирования мембранных белков, но и в результате цАМФзависимого изменения состояния цитоплазматических белков. Так, АДГ активирует транспорт воды через апикальную поверхность клеток почечных канальцев и собирательных трубочек почки путем изменения вязкости мембраны, которое достигается цАМФзависимым фосфорилированием тубулина и других белков, приводящим к стабилизации микротрубочек и микрофиламентов, регулирующих вязкость мембраны и ее проницаемость. Влияние альдостерона на реабсорбцию натрия из первичной мочи в дистальных отделах нефронов опосредуется непосредственной индукцией (через геном) под его влиянием синтеза белков натриевых каналов.

Наконец, некоторые мембраннотропные гормоны, активирующие аденилатциклазу, могут и непосредственно (без участия цАМФзависимого фосфорилирования определенных белков) оказывать влияние на проницаемость мембран для ионов. Так, катехоламины, действуя через b-адренорецепторы некоторых клеток (например, эритроцитов птиц), без участия цАМФзависимого фосфорилирования повышают проницаемость мембран для кальция или вызывают высвобождение кальция из мембранносвязанного состояния, а в ряде тканей тормозят активный транспорт магния. Простагландины F путем изменения состояния собственных рецепторов приводят к тому, что сами рецепторы приобретают способность выступать в роли ионофоров для кальция в плазматической мембране.

Нейромедиаторы, действующие на постсинаптическую мембрану иннервируемой клетки, благодаря высокой плотности рецепторов на относительно малом участке мембраны вызывают биологический эффект в течение миллисекунд. Влияние же гормонов на проницаемость мембран, опосредуемое в большинстве случаев химическими процессами и внутриклеточными посредниками, вызывающими изменение состояния переносчиков или каналов, реализуется с гораздо большим латентным периодом. Кроме того, рецепторы для гормонов, как правило, диффузно с меньшей степенью концентрации, чем рецепторы для нейромедиаторов на постсинаптической мембране, распределены по всей поверхности мембраны клетки-мишени. В связи с отмеченным от момента связывания гормона с рецептором до регистрируемых изменений транспорта ионов или метаболитов проходят десятки секунд или даже минут.

Таким образом, первый способ регуляции состояния клеток-мишеней под влиянием нейромедиаторов и мембраннотропных гормонов осуществляется путем временного обратимого изменения проницаемости их мембран для ионов или низкомолекулярных органических веществ, что может сопровождаться временным изменением мембранного потенциала или поступлением в клетку субстратов окисления, метаболитов или кофакторов, а, следовательно, сказываться на течении обмена веществ и функциональных отправлениях клетки-мишени. Такой способ регуляции состояния клетки является одним из наиболее эффективных способов усиления регуляторного сигнала, поскольку при связывании одной молекулы гормона с рецептором временно возникают условия для перемещения через мембрану тысяч ионов или других молекул. Каждая молекула, вошедшая в клетку, может взаимодействовать с ферментом или регуляторным белком, изменяя их активность. При этом достигается дополнительное усиление сигнала, поскольку повышение или понижение активности ферментов или мембранного потенциала приводит к изменению скорости протекания биохимических процессов и, как следствие, функционального состояния клетки-мишени.

Регуляция биологически активными веществами активности ферментов путем обратимого их фосфорилирования. Данный способ регуляции метаболической и функциональной активности клеток-мишеней достигается благодаря изменению концентрации определенных внутриклеточных посредников и под их влиянием активности ферментов, способных вызывать обратимое фосфорилирование других белков клетки (в том числе ферментов), что сопровождается временным обратимым изменением функциональной и метаболической активности клеток-мишеней. Так, внутриклеточными посредниками действия большинства мембраннотропных биологически активных веществ (гормонов гипоталамуса, аденогипофиза, глюкагона, простагландинов Е, катехоламинов при действии их через b-адренорецепторы) являются кальций, цАМФ, цГМФ, и метаболиты фосфатидилинозитола (инозитолтрифосфат и диацилглицерол). При этом превращение внешнего сигнала во внутренний осуществляется в тех компонентах мембран, которые выполняют функцию воспринимающего (рецептор), сопрягающего (N-белки) и каталитического (аденилатциклаза или фосфолипаза С) элементов. Центральными же внутриклеточными звеньями гормональной сигнализации (акцепторами) в большинстве случаев выступают протеинкиназы, активируемые под влиянием циклических нуклеотидов (вторичных посредников передачи гормонального сигнала). Активированные протеинкиназы путем фосфорилирования ряда внутриклеточных белков модулируют их активность, что сказывается на функциональных или метаболических отправлениях клетки-мишени.

Сущность аденил- и гуанилатциклазного пути действия биологически активных веществ на клетки-мишени. Одним из путей регуляции каталитической активности ферментов является их фосфорилирование под действием протеинкиназы, активированной внутриклеточным посредником действия гормона – цАМФ. Образование же цАМФ в клетке-мишени осуществляется под влиянием активированной аденилатциклазы, в связи с чем данный механизм действия гормонов, запускаемый через мембранные рецепторы, получил название аденилатциклазного механизма. Сущность этого механизма состоит в следующем. Гормон специфически взаимодействует с мембранным рецептором, в результате чего образуется гормон-рецепторный комплекс, который влияет на состояние расположенного поблизости мембранносвязанного N-белка (или трансдуцина). N-белок имеет олигомерную природу и состоит из 3-ех субъединиц (a, b и g) разного молекулярного веса (суммарный молекулярный вес всех субъединиц составляет 100 000), он не является видо- и тканеспецифичным. В неактивном состоянии N-белок способен дефосфорилировать ГТФ до ГДФ и фосфата (т.е. проявляет ГТФ-азную активность). Под влиянием гормон-рецепторного комплекса N-белок претерпевает конформационные изменения (диссоциирует на субъединицы), в результате которых утрачивает способность расщеплять ГТФ. Отмеченные конформационные изменения N-белка обуславливают присутствие в активном центре его a-субъединицы не ГДФ, а ГТФ. В комплексе с ГТФ отделившаяся от других субъединиц a-субъединица N-белка приобретает способность вызывать конформационные перестройки другого мембранносвязанного и расположенного поблизости белка-фермента – аденилатициклазы. Отделение a-субъединицы N-белка от каталитической субъединицы аденилатциклазы лишает фермент активности (способности катализировать превращение Mg²⁺-АТФ в цАМФ). Считают, что диссоциация N-белка на субъединицы, сопровождающаяся активацией его a-субъединицы, присоединением ею ГТФ и активацией под ее влиянием аденилатциклазы, является не бесконечным процессом. Так, взаимодействие a-субъединицы с аденилатциклазой приводит к возникновению избытка свободных b- и g- субъединиц и по закону действующих масс – к обратной реассоциации субъединиц N-белка, что возвращает его в неактивное состояние. Но при этом, вызвав замещение в ГТФ-связывающем центре N-белка ГДФ на ГТФ, гормон-рецепторный комплекс остается неизменным и может вновь включиться в цикл активации N-белка. Таким образом, между количеством рецепторов, связавших гормон, и количеством молекул аденилатциклазы, перешедших в активное состояние, нет четкой зависимости. Скорость же синтеза цАМФ определяется количеством каталитических субъединиц аденилатциклазы, находящихся в комплексе с N-белком, и зависит от состояния N-белка, которое, в свою очередь, зависит от сохранности гормон-рецепторного комплекса. В частности, разрушение гормон-рецепторного комплекса приводит к восстановлению способности N-белка гидролизовать ГТФ, в результате чего он утрачивает способность взаимодействовать с аденилатциклазой и активировать ее. Сами гуаниловые нуклеотиды уменьшают сродство рецептора к гормону, ограничивая тем самым существование гормон-рецепторного комплекса, а гормон может уменьшать сродство N-белка к гуаниловым нуклеотидам. Так, на мембранном препарате кардиомиоцитов показано, что добавление в среду инкубации ГТФ снижает сродство β-адренорецепторов к селективному их агонисту изопротеренолу. Таким образом, сам гормон, связываясь с рецептором, с одной стороны, вызывает активацию N-белка, а, с другой – обуславливает обратимость активности N-белка и соответственно аденилатциклазы, поскольку способствует уменьшению сродства N-белка к ГТФ.

Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок плазматических мембран, активный центр которого расположен на внутренней стороне мембраны. Она присутствует практически во всех клетках животного организма; ее не удалось выявить только в эритроцитах человека и некоторых мутантных линиях культивируемых клеток. В тканях животных содержание аденилатциклазы крайне низко. Так, в очищенных мембранных препаратах ее активность не превышает 100 пмоль/мг белка в минуту, что в 1000 раз ниже активности других мембранных ферментов (например, АТФаз). Обнаружено несколько десятков природных активаторов аденилатциклазы, в числе которых гормоны, гормоноподобные вещества, нейромедиаторы и токсины. Чувствительность аденилатциклазы к этим веществам полностью определяется наличием соответствующих рецепторов в плазматической мембране клетки: сами биологически активные вещества непосредственно аденилатциклазу не активируют, не активируют ее непосредственно и гормон-рецепторные комплексы (они действуют на нее через N-белок). В некоторых тканях млекопитающих ГТФ может непосредственно (в отсутствии гормона) влиять на активность аденилатциклазы, тогда как гормон лишь ускоряет замещение ГДФ на ГТФ. Известны и факторы, ингибирующие активность аденилатциклазы, к числу которых относятся опиоиды, α₂-адренергические агенты, М-холиномиметики, аденозин. Эффекты этих ингибирующих аденилатциклазу веществ также тканеспецифичны (т.е. зависят от наличия в клетках рецепторов к этим веществам). Скорость перехода аденилатциклазы в активное состояние под действием N-белка, присоединившего ГТФ, определяется скоростями связывания гормона с рецептором, замещения ГДФ на ГТФ в активном центре N-белка и образования комплекса между N-белком и каталитической субъединицей фермента. Переход аденилатциклазы из активного состояния в неактивное определяется, прежде всего, скоростью гидролиза ГТФ N-белком. Следовательно, скорость синтеза цАМФ в клетке зависит от скорости взаимодействия гормона с рецептором, скорости активации N-белка гормон-рецепторным комплексом и скорости взаимодействия и активации N-белком аденилатциклазы. Полупериод жизни комплекса между катехоламином и β-адренорецептором составляет около 5 минут, а константа скорости перехода аденилатциклазы из неактивного состояния в активное составляет 0,4-1 минуту^-1. Это значит, что один и тот же гормон-рецепторный комплекс за период своего существования потенциально способен активировать через активированный N-белок аденилатциклазу до 10 раз. Причем в естественных условиях в качестве ингибитора ГТФазной активности N-белка может выступать фермент АДФ-рибозилтрансфераза. Так, при АДФ-рибозилировании N-белка практически полностью подавляется его ГТФазная активность, в результате чего повышается стационарный уровень активной формы аденилатциклазы. Таким образом, в тканях животных, очевидно, функционирует фермент, регулирующий функциональное сопряжение мембранных рецепторов с аденилатциклазой. Не исключено, что АДФ-рибозилтрансфераза тканей позвоночных является регулируемым ферментом, через который замыкается обратная связь в реакциях гормонзависимого синтеза циклических нуклеотидов.

Подобно тому, как изменение константы связывания гормона с рецептором или концентрации рецепторов влияет на чувствительность клетки к гормону, воздействие разных факторов на ту или иную реакцию в многоступенчатом процессе регуляции активности аденилатциклазы может вызывать усиление или ослабление функционального сопряжения рецептора с ферментом, что также приведет к изменению чувствительности клетки-мишени к гормону.

Наряду с образованием цАМФ, как внутриклеточного посредника действия гормонов, некоторые биологически активные вещества (некоторые нейромедиаторы, натрийуретический фактор при действии на клетки нефронов почки) вызывают образование в качестве внутриклеточного посредника цГМФ, путем активации через N-белок гуанилатциклазы. Считается, что активация гуанилатциклазы может осуществляться и в результате непосредственного действия на нее ионов кальция. В отличие от аденилатциклазы, гуанилатциклаза находится как в мембранносвязанном, так и в растворимом состоянии. Причем соотношение между мембранной и цитозольной формами гуанилатциклазы в различных тканях различно. Более того, изменение функционального состояния ткани также влияет на внутриклеточную локализацию гуанилатциклазы. Так, при регенерации печени отмечается 2-3-кратное повышение активности данного фермента в мембранах, в том числе и в ядерных. Установлено, что отщепление гуанилатциклазы от мембраны, как правило, активирует фермент. Активность гуанилатциклазы в разных тканях не превышает 1-2 пмоль/мг белка в минуту, что гораздо ниже активности аденилатциклазы и объясняется крайне низким содержанием фермента. В связи с более низкой активностью гуанилатциклазы, в сравнении с таковой аденилатциклазы, концентрация цГМФ в клетке также низка (составляет около 10^{-7 М, что в 4-10 раз ниже концентрации цАМФ). При активации синтеза или подавлении распада цГМФ его концентрация в клетке обычно повышается в 3-8 раз.}

Циклический ГМФ, как правило, служит внутриклеточным посредником в передаче сигнала некоторыми нейромедиаторами (в частности, ацетилхолином) и гормонами (например, при действии натрийуретического фактора на клетки нефронов почки). Установлено, что ацетилхолин в некоторых клетках-мишенях активирует гуанилатциклазу, и эта активация опосредуется входом кальция в клетку. Серотонин может активировать гуанилатциклазу и соответственно синтез цГМФ в гладких мышцах артерий человека, и этот процесс протекает в отсутствии кальция в омывающей среде. Описанный механизм действия медиаторов на клетки-мишени с участием цГМФ не является универсальным для всех нейромедиаторов. В большинстве тканей млекопитающих гуанилатциклаза может активироваться непосредственно под действием оксида азота, кислорода, перекиси водорода, жирных кислот и продуктов их перекисного окисления, а также под действием многих агентов, стимулирующих окислительные процессы в мембране.

Концентрация цАМФ и цГМФ в клетке зависит от скорости их образования и разрушения и регулируется, с одной стороны, аденил- или гуанилатциклазой, а, с другой, – фосфодиэстеразой. Фосфодиэстеразы не обладают абсолютной специфичностью в отношении субстратов: в подавляющем большинстве случаев одна и та же форма фермента способна гидролизовать как цАМФ, так и цГМФ. Но при этом соотношение скоростей гидролиза этих двух циклических нуклеотидов может быть разным и зависит от формы фермента (существуют ферменты, более специфичные в отношении цАМФ или цГМФ), соотношения концентраций цАМФ и цГМФ в клетке и от действия регуляторов фосфодиэстеразы.

Фосфодиэстеразы являются преимущественно растворимыми ферментами, частично связанными с внутриклеточными структурами и содержащимися в клетках в концентрациях 10^-7-10^{-6 М. Они представляют собой димеры, состоящие из двух идентичных субъединиц, молекулярный вес которых равен 57000. В отличие от циклаз, фосфодиэстеразы функционируют в клетке в условиях неполного насыщения субстратом (тогда как циклазы не испытывают дефицита в субстрате), в результате чего они никогда не находятся в максимально активном состоянии, а усиливают свою активность по мере повышения концентрации циклических нуклеотидов. Таким образом, гидролиз циклических нуклеотидов ускоряется по мере повышения их концентрации.}

В отсутствии активности аденилатциклазы и соответственно при низкой концентрации цАМФ активность фосфодиэстеразы также оказывается низкой и примерно равна таковой аденилатциклазы. Таким образом, в состоянии физиологического покоя примерно с одинаковой скоростью идет синтез и гидролиз цАМФ, и ее содержание может долго поддерживаться на постоянном уровне. В случае же образования мембранных гормон-рецепторных комплексов происходит активация аденилатциклазы, в результате чего скорость образования цАМФ начинает превышать скорость ее распада, что приводит к повышению концентрации цАМФ в клетке. Но вскоре повышенная концентрация цАМФ вследствие лучшего насыщения фосфодиэстеразы обуславливает повышение ее активности и, как следствие, ускорение разрушения цАМФ. Кроме того, установлено, что цАМФ через реакции фосфорилирования мембран или других структур вызывает повышение концентрации кальция в цитоплазме и стимуляции выхода кальмодулина из мембран в цитоплазму. Ионы кальция в комплексе с кальмодулином (обнаружен во всех эукариотических клетках, представляет собой одноцепочечный белок, состоящий из 148 аминокислотных остатков и имеющий молекулярный вес 16700, состоит из 4-ех доменов, каждый из которых связывает кальций), активируют фосфодиэстеразу. При низкой концентрации кальция кальмодулин находится преимущественно в связанном с мембраной состоянии, тогда как после связывания с кальцием – переходит в цитозоль, а также взаимодействует с другими органеллами клетки.

При повышении концентрации кальция в цитоплазме к фосфодиэстеразе присоединяются две молекулы кальмодулина. Комплекс кальций-кальмодулин вызывает повышение активности фосфодиэстеразы в 6-10 раз. Стимуляция активности фосфодиэстеразы может быть вызвана и другими агентами, повышающими уровень кальция в цитоплазме (в частности, ацетилхолином, или α-адерноагонистами). Снижение концентрации кальция в цитоплазме приводит к отщеплению его от кальмодулина, и комплекс кальций-кальмодулин расщепляется. Регуляция активности фосфодиэстеразы ионами кальция и кальмодулином представляет собой быстрый и обратимый процесс. Кроме регуляции содержания цАМФ в клетке фосфодиэстеразой, активируемой комплексом кальций+кальмодулин, оно может регулироваться и агентами, ингибирующими аденилатциклазу (например, ацетилхолином и α-адерноагонистами).

Таким образом, при быстром ускорении синтеза цАМФ происходит медленное (в течение десятков секунд или минут) повышение содержания цАМФ в клетке, поскольку увеличение концентрации циклических нуклеотидов активирует и фосфодиэстеразы, расщепляющие цАМФ и цГМФ. В результате проявления активности фосфодиэстеразы концентрация цАМФ снижается к исходному уровню, что приводит к постепенному угасанию регуляторного сигнала гормона, несмотря на то, что гормон присутствует в среде, а синтез цАМФ идет с повышенной скоростью.

Сродство цАМФ- и цГМФзависимых протеинкиназ к циклическим нуклеотидам в 100-1000 раз больше, чем у фосфодиэстераз. Отмеченный факт обуславливает то обстоятельство, что первоначально (при ускорении синтеза циклических нуклеотидов) они преимущественно насыщают регуляторные центры протеинкиназ (связывая циклические нуклеотиды, протеинкиназы временно защищают их от гидролиза) и лишь затем (по мере высвобождения из активных центров протеинкиназ) – фосфодиэстераз, что приводит к усилению гидролиза циклических нуклеотидов. Таким образом, циклические нуклеотиды по мере повышения своей концентрации в клетках-мишенях под действием гормон-рецепторных комплексов первоначально активируют протеинкиназы, вызывающие дальнейшую активацию других ферментов путем их фосфорилирования, и только потом фосфодиэстеразы, катализирующие распад циклических нуклеотидов и, как следствие, прекращающие их действие на клетку.

Следовательно, фосфодиэстеразы могут осуществлять контроль за максимальной степенью повышения концентрации циклических нуклеотидов в клетке и даже при необратимой активации аденилатциклазы (которую вызывает, например, холерный токсин, он необратимо активирует N-белок путем его АДФ-рибозилирования и соответственно аденилатциклазу в слизистой кишечника, что приводит к потери ею жидкости и электролитов и нарушению их всасывания из желудочно-кишечного тракта) содержание цАМФ в клетке возрастает всего лишь в несколько раз (несмотря на то, что синтез цАМФ ускорен в 5-10 раз и протекает с такой скоростью в течение нескольких часов и даже суток). Более того, при длительном повышении активности аденилатциклазы и соответственно длительном повышении уровня цАМФ в клетке активность фосфодиэстеразы возрастает не только вследствие ее активации, но и в результате усиления ее синтеза в клетке.

Акцептором действия цАМФ и цГМФ в клетках являются протеинкиназы, выступающие в роли регуляторных ферментов. В функциональном отношении они являются АТФ-фосфотрансферазами: способны фосфорилировать путем переноса фосфатной группы от АТФ аминокислотные остатки серина, треонина или тирозина в молекуле белка, образуя фосфорилированную форму белка. При этом изменяется конформация фосфорилированной белковой молекулы, что приводит к изменению функционального состояния белка: он либо активируется, либо ингибируется. Протеинкиназы обладают способностью связывать по 4 молекулы циклических нуклеотидов. цАМФ-зависимая протеинкиназа (холофермент) является тетрамером, состоящим из двух разных типов субъединиц – каталитических и регуляторных (суммарный молекулярный вес – 152000-174000). При связывании цАМФ происходит диссоциация холофермента на регуляторный димер (каждая из его субъединиц имеет молекулярный вес 42000-55000) и две каталитические субъединицы (молекулярный вес 38000-42000). Сам холофермент не обладает каталитической активностью. После отщепления каталитических субъединиц от регуляторного димера они приобретают фосфотрансферазную активность. Следовательно, регуляторные субъединицы оказывают ингибирующее влияние на каталитические. Протеинкиназа, зависимая от цАМФ, способна к аутофосфорилированию (в результате реакции с АТФ). Аутофосфорилированию подвергается регуляторный димер, в результате чего уменьшается его сродство к каталитическим субъединицам, и под действием присоединяющейся цАМФ они легче отщепляются от регуляторного димера. В частности, диссоциацию фосфорилированного холофермента вызывают в 5-6 раз меньшие концентрации цАМФ, чем нефосфорилированного.

Протеинкиназа, зависимая от цГМФ (молекулярный вес 150000), не способна к аутофосфорилированию. Связывание цГМФ не вызывает ее диссоциации на регуляторный димер и каталитические субъединицы, но переводит из неактивного состояния в активное. Удаление из среды цГМФ сопровождается инактивацией цГМФзависимой протеинкиназы. Скорость этого перехода зависит только от константы скорости диссоциации цГМФ из регуляторного центра, тогда как скорость инактивации цАМФзависимой протеинкиназы при понижении концентрации цАМФ зависит не только от скорости диссоциации цАМФ от регуляторного димера, но и от скорости его реассоциации с каталитическими субъединицами. В результате отмеченного инактивация цАМФзависимой протеинкиназы при понижении концентрации цАМФ протекает гораздо медленнее, чем цГМФзависимой.

После того, как внешний регуляторный сигнал, вызвавший повышение концентрации цАМФ в клетке, прекратился, содержание цАМФ в цитоплазме понижается до исходного уровня, молекулы цАМФ диссоциируют от регуляторного димера, вследствие чего он вновь связывается с каталитическими субъединицами, и фосфотрансферазная активность протеинкиназы снижается.

В состоянии физиологического покоя в клетке концентрация цАМФ и цГМФ такова, что они не способны вызвать активации протеинкиназ, но достаточно увеличить концентрацию циклических нуклеотидов на 20-30% и начинается активация протеинкиназ. В скелетной мышце увеличение концентрации цАМФ всего в 4-5 раз приводит к практически полной активации цАМФзависимой протеинкиназы.

Наряду с фосфодиэстеразами, метаболизирующими циклические нуклеотиды, важную роль в прекращении реализации гормонального сигнала в клетке-мишени играют фосфатазы. Они дефосфорилируют белки, фосфорилированные под действием цАМФзависимой протеинкиназы и благодаря этому временно изменившие свое состояние, и других ферментов, активированных под ее влиянием. Дефосфорилирование белков возвращает всю систему передачи гормонального сигнала внутри клетки в неактивное состояние. При этом именно наличие фосфодиэстераз и фосфатаз, инактивирующих внутриклеточные ферментативные каскады передачи гормонального сигнала, обуславливает пороговость реакций клеток-мишеней на гормон. В частности, в некоторых пределах начало реакции клетки-мишени на гормон зависит от его концентрации, но после инициации начала реакции она приобретает лавинообразный характер по причине усиления сигнала в результате работы ферментативного внутриклеточного каскада. Так, при очень низких концентрациях гормона и соответственно малой степени оккупации им рецепторов клетки-мишени, концентрация образующейся цАМФ очень низка, что приводит к активации небольшого количества молекул протеинкиназы и соответственно фосфорилированию небольшого количества белков-акцепторов протеинкиназы. Это небольшое количество фосфорилированных белков успевает тут же дефосфорилироваться фосфатазами и не может значимо повлиять на функциональные или метаболические процессы в клетке-мишени. Вместе с тем, увеличение концентрации гормона вокруг клетки-мишени до пороговых значений приводит к значительному повышению уровня цАМФ внутри клетки и, как следствие, активации большего количества молекул протеинкиназы, а значит, появлению еще большего количества молекул фосфорилированных белков, которые не успевают тут же дефосфорилироваться фосфатазами, в связи с чем начинают оказывать временное обратимое влияние на состояние клетки-мишени. Кроме того, активированная протеинкиназа путем фосфорилирования частично ингибирует фосфатазы, что замедляет дефосфорилирование активированных белков и способствует временной фиксации клетки в активированном состоянии. По достижении концентрации гормона вокруг клетки-мишени порогового уровня активируется и начинает самоусиливаться внутриклеточный ферментативный каскад передачи гормонального сигнала и генерируется ответная реакция клетки максимально возможной силы.

Передача сигнала от мембранного рецептора через синтез циклических нуклеотидов и их действие на акцепторы (протеинкиназы) представляет собой каскадную систему усиления внеклеточного сигнала. Так, одна молекула гормона, присоединившись к рецептору, активирует одну или несколько молекул аденилатциклазы, в результате чего внутри клетки образуются тысячи молекул цАМФ. На этом этапе сигнал усиливается в 100-1000 раз. Образующийся цАМФ активирует другой катализатор – протеинкиназу, усиливая при этом сигнал еще в 100 раз. Далее сигнал усиливается еще в сотни раз в результате активации протеинкиназой путем фосфорилирования других ферментов. В конечном итоге суммарное усиление сигнала составляет 10⁶-10⁷ раз. Иными словами, благодаря механизму каскадного усиления одна молекула внешнего регулятора потенциально способна к изменению состояния или структуры миллионов других молекул. Этот механизм регуляции может воздействовать (прямо или опосредованно) на многие метаболические процессы и клеточные функции. Без механизма каскадного усиления ни гормоны, присутствующие в крови в ничтожно малых концентрациях (10^-7-10^{-10 М), ни кальций и циклические нуклеотиды, концентрация которых не превышает 10-6 М, не могли бы регулировать активность акцепторных ферментов, поскольку их концентрация в клетке (10-5 М) выше таковой гормона и внутриклеточных посредников его действия.}

В большинстве случаев в ферментном каскаде с участием цАМФ осуществляется двухэтапное усиление – на стадии активации аденилатциклазы и цАМФзависимой протеинкиназы. В случае участия в ферментативном каскаде цГМФ достигается еще большая степень усиления, поскольку синтез цГМФ под действием цГМФзависимой протеинкиназы инициируется входящим в клетку кальцием. Следовательно, цГМФ, в отличие от цАМФ, является уже не первым, а вторым посредником действия гормона на клетку, что и обеспечивает большую степень усиления, чем при образовании цАМФ.

Многократное усиление в ферментативном каскаде, запускаемом гормонами, обусловлено еще и существованием градиента концентрации ферментов, входящих в него. Так, концентрация аденилатциклазы в клетке ничтожно мала (составляет около одной миллионной от содержания других белков), тогда как концентрация цАМФзависимой протеинкиназы выше (составляет несколько тысячных от общего содержания белков в клетке), а содержание ферментов, активируемых протеникиназой путем фосфорилирования гораздо больше такового протеинкиназы (составляет 1-4% от общего содержания клеточных белков). Кроме того, усиление гормонального сигнала может достигаться и благодаря одновременному, но противоположному характеру влиянию гормона, опосредуемого его внутриклеточными посредниками, на регулируемые метаболические или функциональные отправления клеток-мишеней. Так, в одной и той же клетке цАМФ, образующаяся под влиянием катехоламинов, оказывает через активацию протеинкиназы такое действие на цитозольные ферменты, что стимулируется расщепление гликогена на фоне одновременного торможения его синтеза. Инсулин стимулирует синтез жиров в жировых клетках, одновременно уменьшая их распад за счет ингибирования липаз.

Передача гормонального сигнала аденилатциклазным или гуанилатциклазным путем сопровождается постоянным потреблением энергии на синтез циклических нуклеотидов и на фосфорилирование под влиянием активированной ними протеинкиназы других белков. Энергозависимыми являются также процессы активации гормон-рецепторным комплексом N-белка (поскольку требуют ГТФ) и активация цАМФзависимой протеинкиназы (поскольку зачастую для осуществления активации данного фермента требуется не только цАМФ и АТФ для аутофосфорилирования фермента). Энергозависимость процессов ферментативного каскада, инициируемого мембраннотропными гормонами, делает невозможным его обратимость. Наличие в ферментативном каскаде факторов, гасящих его (в частности, фосфодиэстеразы), а также обратимость взаимодействия гормона с рецептором обеспечивают дискретность активности ферментативного каскада.

Таким образом, ферментативный каскад состоит из целого ряда ферментов, каждый из которых находится под метаболическим контролем (испытывает регуляторное воздействие внутриклеточных метаболитов, кофакторов и коферментов). Благодаря такой множественной регуляции активности компонентов ферментативного каскада достигается сложная интеграция внутриклеточных и внеклеточных процессов и коррекция внутренними факторами внешних регуляторных воздействий. Последовательное же участие в ферментативном каскаде целого ряда ферментов делает регуляцию со стороны метаболитов и кофакторов более тонкой и множественной. Кроме того, каждый из этапов передачи сигнала в ферментативном каскаде находится под контролем специальных защитных механизмов, ограничивающих его длительную активацию. Так, длительное действие гормона приводит к десенсебилизации мембранных рецепторов, в результате чего степень активации аденилатциклазы снижается. Если концентрация цАМФ в клетке длительное время повышена, может происходить фосфорилирование мембран, сопровождающееся увеличением содержания кальция в клетке. Кальций, в свою очередь, активирует гуанилатциклазу, что сопровождается образованием цГМФ, а цГМФ зачастую оказывает эффекты, противоположные цАМФ. Кроме того, кальций в комплексе с кальмодулином активируют фосфодиэстеразу, расщепляющую цАМФ, что также будет способствовать ограничению ее влияния на клетку. Длительно повышенная концентрация цАМФ приводит к увеличению синтеза фосфодиэстеразы (что обуславливает ускорение распада цАМФ) и белковых факторов, снижающих сродство протеинкиназы к цАМФ. Сама цАМФ вначале активирует протеинкиназу, но затем ускоряет реассоциацию регуляторного димера с каталитическим субъединицами (путем облегчения дефосфорилирования регуляторной субъединицы фосфопротеинфосфатазой), что возвращает фермент в неактивное состояние. Наконец, защита от перевозбуждения под действием гормонального сигнала может достигаться и на уровне ферментов, активируемых протеинкиназой. В частности, при активации протеинкиназой киназы фосфорилазы происходит быстрое фосфорилирование ее b-субъединицы (которая собственно и активирует фосфорилазу) и более медленное фосфорилирование a-субъединицы, которая, становясь активной, ускоряет дефосфорилирование b-субъединицы, ограничивая продолжительность нахождения киназы фосфорилазы в активном состоянии.

Таким образом, в многократно усиливающемся ферментативном каскаде аденилатциклазного механизма действия мембраннотропных гормонов действуют и многочисленные ограничивающие факторы. Существование большого многообразия ограничивающих факторов, очевидно, связано с тем, что через систему циклических нуклеотидов действуют главным образом гормоны, стимулирующие катаболизм веществ в клетке. Если бы не срабатывали механизмы защиты, то стимуляция синтеза цАМФ адреналином могла бы вызвать полное расщепление гликогена в скелетных мышцах всего за несколько минут. Также быстро организм лишился бы и жировых запасов. Быстрое же сжигание энергетических ресурсов сопровождалось бы, с одной стороны, истощением организма, а, с другой – перегревом и тяжелыми функциональными расстройствами.

Роль кальция и кальмодулина в передаче внешнего гормонального сигнала в клетке. Кальций, кроме участия в комплексе с кальмодулином в активации фосфодиэстеразы, может сам выступать в роли внутриклеточного посредника действия гормонов. Концентрация кальция в нестимулированной (покоящейся) клетке очень низка: составляет всего 1/10 000 от концентрации кальция во внеклеточной жидкости (0,1мкМ и менее), тогда как в стимулированной – может возрасти до 0,6-2,0 мкМ. При этом внешний гормональный сигнал способен приводить к увеличению внутриклеточной концентрации кальция следующими способами:

ü благодаря облегчению притока кальция в клетку из межклеточных пространств

ü за счет торможения его оттока из клетки

ü путем мобилизации внутренних запасов кальция из эндоплазматического ретикулума, плазматической мембраны и митохондрий.

Повышение концентрации кальция в клетке-мишени может стимулировать ее сокращение (в мышечных клетках), секрецию некоторых веществ (в секреторных клетках, секретирующих вещества путем экзоцитоза в составе мембранных везикул), изменение состояния кальцийзависимых белков (в том числе ферментов). В ряде случаев кальций может служить необходимым фактором для полного запуска и осуществления цАМФзависимых ферментативных каскадов, активируемых некоторыми мембраннотропными гормонами. Так, адреналин, действуя через посредство цАМФ, на скелетные мышечные волокна стимулирует гликогенолиз и одновременно тормозит синтез гликогена в них, что способствует повышению содержания глюкозы внутри мышечного волокна и соответственно улучшению его энергетического обеспечения. Однако такое действие адреналина проявляется только на сокращающиеся мышечные волокна, тогда как в покоящихся – под действием адреналина цитоплазматическая концентрация глюкозы не изменяется. Отмеченный факт имеет большое биологическое значение (поскольку мобилизация глюкозы из гликогена происходит только в случае работы мышцы) и обусловлен участием кальция в активации некоторых ферментов цАМФактивируемого ферментативного каскада. В частности, кальций необходим для активации под влиянием цАМФактивированной протеинкиназы другого фермента – киназы фосфорилазы, которая, в свою очередь, активирует ключевой фермент гликогенолиза фосфорлазу путем ее фосфорилирования. Повышение же внутриклеточной концентрации кальция в скелетном мышечном волокне происходит только в случае его возбуждения и инициирует сокращение волокна. В связи с этим реализация цАМФстимулируемого ферментативного каскада под влиянием адреналина в мышечном волокне, сопровождающаяся усилением гликогенолиза, будет иметь место только при повышении цитоплазматической концентрации кальция, что стимулирует одновременно процесс сокращения.

Несмотря на необходимость периодического временного повышения концентрации кальция в цитоплазме клеток-мишеней для реализации эффекта биологически активных веществ на них, клетки должны бдительно защищать себя от потенциально летальных концентраций кальция. Так, при накоплении в клетке слишком большого количества кальция образуется малорастворимая его соль с АТФ, что приводит к нарушению продукции и утилизации АТФ. В связи с этим в процессе эволюции сформировались различные способы уменьшения концентрации кальция внутри клеток: путем откачки кальция в саркоплазматический ретикулум, связывания с белками плазматической мембраны, откачки кальция в межклеточные щели благодаря работе кальциевого насоса плазматической мембраны или натрий-кальциевого обмена.

Еще одним посредником в передаче гормонального сигнала внутри клетки может служить кальмодулин. Так, наряду с активацией фосфодиэстеразы, кальмодулин, подобно цАМФ, сам может участвовать в регуляции разнообразных биологических процессов: секреции инсулина, тиреоидных гормонов, гормонов гипофиза и надпочечников, высвобождения нейромедиаторов, кишечной секреции, клеточной пролиферации, высвобождения лизосомальных ферментов, синтеза простагландинов, распада микротрубочек, высвобождения гистамина, подвижности ресничек, лейкоцитарного фагоцитоза и т.д. При этом во всех этих реакциях кальмодулин в комплексе с кальцием активирует специальные кальмодулинчувствительные белки клетки, которые могут представлять собой ферменты, компоненты мембран или органелл. Активация же этих белков сопровождается временным обратимым изменением ряда внутриклеточных процессов. В частности, активация кальций-кальмодулинчувствительных белков в тиреоцитах необходима для осуществления их координированной реакции на ТТГ; несколько иные, но подобные белки, участвуют в регуляции синтеза глюкокортикоидов пучковой зоной коры надпочечников. Комплекс кальций+кальмодулин, подобно цАМФзависимой протеинкиназе, способен активировать киназу фосфорилазы, что сопровождается усилением гликогенолиза в клетках-мишенях. Кроме активации белков-ферментов, комплекс кальций+кальмодулин может активировать киназу легких цепей миозина, фосфорилирующую миозин, что вызывает сокращение гладких мышц. Наконец, комплекс кальций+кальмодулин путем активации определенных киназ участвует в осуществлении синаптической передачи и в синтезе белка в клетках-мишенях.

Комплекс кальций+кальмодулин может изменять активность белков (увеличивая или уменьшая ее) одним из двух способов:

ü путем прямого взаимодействия с ферментом-мишенью

ü под действием активируемой комплексом кальций+кальмодулин протеинкиназы. Действие этой протеинкиназы полностью аналогично таковому цАМФзависимой протеинкиназы (она изменяет состояние белков путем их фосфорилирования), но белки-мишени для этих разных протеинкиназ могут отличаться. Иногда эти две протеинкиназы активируют путем фосфорилирования одни и те же белки, в результате чего могут оказывать в гормончувствительной клетке более выраженный эффект, чем каждая в отдельности.

Сущность инозитолфосфатного механизма действия гормонов на клетки-мишени. Наряду с цАМФ, кальцием и кальмодулином, в передачи гормонального сигнала внутри клетки могут участвовать продукты метаболизма мембранных фосфолипидов (фосфатидилинозитолполифосфата, содержащегося в сравнительно небольшом количестве во внутреннем слое плазматической мембраны) – инозитолтрифосфат и диацилглицерол. Эти вещества могут выступать в роли посредников действия некоторых гормонов, нейромедиаторов, активаторов тромбоцитов и других агонистов, включая фотоны света, действующие на фоторецепторы.

Сущность данного механизма действия биологически активных веществ на клетки-мишени состоит в том, что гормон-рецепторный комплекс через активированный N-белок вызывает активацию мембранносвязанной фосфолипазы С. Фосфолипаза С катализирует гидролиз фосфатидилинозитолполифосфата, в результате чего высвобождаются инозитолтрифосфат и диацилглицерол.

Диацилглицерол остается в плазматической мембране, где в присутствии кальция активирует протеинкиназу С: он резко повышает сродство фермента к кальцию, а собственно активация фермента происходит под действием присоединяющегося кальция. Протеинкиназа С фосфорилирует многие белки по сериновым и треониновым остаткам и имеет некоторые (но не все) общие субстраты с цАМФзависимой протеинкиназой.

Инозитолтрифосфат диффундирует в цитоплазму и вызывает повышение концентрации кальция в цитоплазме путем высвобождения его из внутриклеточных депо (он диффундирует в основном в эндоплазматический ретикулум и стимулирует высвобождение кальция из его цистерн). При этом рецептор для инозитолтрифосфата в эндоплазматическом ретикулуме подобен рианодиновому рецептору, который выступает в роли кальциевого канала в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышечных волокон, но отличается от рианодинового рецептора вдвое большими размерами.

Инактивация инозитолтрифосфата и диацилглицерола в клетке, завершающаяся в конечном итоге ресинтезом фосфатидилинозитолполифосфата, осуществляется путем определенных метаболических реакций, происходящих с участием клеточных ферментных систем. В частности, инозитолтрифосфат последовательно дефосфорилируется до инозитола, а диацилглицерол конвертируется в фосфатидную кислоту, после чего – в цитозиндифосфат-диацилглицерол, который соединяется с инозитолом (продуктом дефосфорилирования инозитолтрифосфата), образуя фосфатидилинозитол и завершая тем самым рабочий цикл.

Взаимодействие различных вторичных посредников действия гормонов внутри клетки-мишени. В роли вторичных посредников действия гормонов могут выступать циклические нуклеотиды (цАМФ и цГМФ), ионы кальция, кальмодулин, активируемый кальцием, и продукты гидролиза фосфатидилинозитолполифосфата (инозитолтрифосфат и диацилглицерол). В ряде случаев один и тот же гормон может действовать на клетку-мишень путем временного повышения концентрации сразу нескольких вторичных посредников (например, цАМФ и кальция, инозитолтрифосфата, диацилглицерола и кальция и т.д.). Характер взаимоотношений между различными вторичными посредниками при реализации гормонального сигнала внутри клетки может быть разным. В целом можно выделить следующие типы взаимодействия между вторичными посредниками внутри клетки:

ü равноправное партнерство, когда оба посредника необходимы для полного проявления биологического эффекта на клетку-мишень

ü какой-то из посредников играет главную роль, тогда как второй лишь способствует реакции, или облегчает ее

ü посредники действуют последовательно, т.е. цАМФ повышает высвобождение кальция, после чего они работают совместно или наоборот. Так, в клетках мозга комплекс кальций-кальмодулин стимулирует аденилатциклазу, что должно потенцировать цАМФзависимые реакции

ü двойной контроль может быть избыточным, дублирующим или страховочным

ü посредники являются антагонистами (выступают в роли тормоза или сигнала выключения друг друга). Например, кальций в комплексе с кальмодулином активирует фосфодиэстеразу, которая расщепляет цАМФ, уменьшая ее содержание в клетке-мишени. В некоторых клетках комплекс кальций-кальмодулин ингибирует аденилатциклазу, что должно также ограничивать выраженность цАМФзависимых реакций

ü разные посредники могут действовать в разных временных интервалах. Например, при стимуляции секреции инсулина глюкозой или альдостерона ангиотензинном II вначале возрастает концентрация кальция под действием внешнего (гормонального) сигнала (кальций активирует кальмодулин), а уже через несколько минут концентрация кальция возвращается к исходной, несмотря на продолжающееся действие агониста. При этом ответ клетки-мишени на действие агониста сохраняется в течение часа и более. Дальнейшее поддержание реакции клеток на гормон обеспечивается активированной протеинкиназой С. Второй пример: кальций может играть важную роль в качестве сигнала для высвобождения арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов; арахидоновая кислота, в свою очередь, является источником синтеза простагландинов.

Таким образом, одни внутриклеточные посредники гормональных сигналов способны оказывать регулирующее влияние (как стимулирующее, так и ингибирующее) на состояние других. Причем характер взаимоотношений между вторичными посредниками действия гуморальных регуляторов является различным в разных клетках-мишенях.

Наконец, один и тот же посредник может оказывать разное влияние на различные ферментные системы клетки-мишени: одни ферментные системы активировать, тогда как другие ингибировать, что важно для эффективного действия гормонального регулятора. Так, в печеночных клетках активированная под влиянием цАМФ протеинкиназа путем фосфорилирования активирует фосфорилазу В, которая запускает ферментативный каскад, катализирующий в конечном итоге гликогенолиз. При этом, если бы сохранялась высокая скорость синтеза гликогена активация гликогенолиза была бы малоэффективной, поскольку высвобождающаяся глюкоза поступала бы не в кровь, а вновь бы использовалась в гепатоцитах для синтеза гликогена. Вместе с тем, в реальных условиях активация гликогенолиза, запускаемая цАМФ, в печеночных клетках сопровождается торможением синтеза гликогена, поскольку при цАМФзависимой активации фосфорилазы (путем ее фосфорилирования протиенкиназой) происходит и фосфорилирование активной протеинкиназой гликогенсинтетазы, но при этом гликогенсинтетаза в результате фосфорилирования, напротив, инактивируется. Другой пример синхронного фосфорилирования имеет место в клетках коры надпочечников при стимуляции их АКТГ. В этом случае цАМФзависимая протеинкиназа фосфорилирует не менее трех белков: гидролазу эфиров холестерола (поставляет холестерол для биосинтеза стероидных гормонов), рибосомный белок, участвующий в трансляции специфического белка, необходимого для синтеза гормонов, и фосфорилазу, обеспечивающую гликогенолиз (поставляющий энергию для биосинтеза стероидных гормонов). Таким образом, каждая чувствительная к гормональному регулятору клетка содержит свой собственный набор субстратов протеинкиназ, играющих существенную роль в ее жизнедеятельности и определяющих характер влияния гормональных регуляторов на нее. Следовательно, клетка формирует специфический ответ, несмотря на то, что многие молекулярные компоненты реагирующей системы у данной клетки такие же, как и у других, запрограммированных на иные реакции природой и распределением субстратов протеинкиназ.

Регуляция биологически активными веществами трансляции генетической информации в клетке-мишени.

Интенсивность белкового синтеза зависит от большого колическтва факторов: функционального состояния генома, наличия пластического и энергетического материала, количества рибосом и состояния мембран эндоплазматического ретикулума, активности ферментов, осуществляющих процессинг и разрушение нуклеиновых кислот и ряда другних. В силу этого интенсивность метаболизма разных веществ (в частности, углеводов, служащих источником энергии для пластического обмена) может сказываться на скорости синтеза белка. Синтез белка может регулироваться под влиянием многих метаболитов и ионов, в связи с чем гормоны и нейромедиаторы, изменяющие проницаемость плазматической мембраны для этих веществ, могут косвенно влиять на синтез белка. Кроме того, белковый синтез может изменяться под действием некоторых ферментов, активированных путем обратимого фосфорилирования. Отмеченное обуславливает тот факт, что гормоны и нейромедиаторы, оказывающие влияние на активность ферментов, также способны опосредованно регулировать пластический обмен в клетке-мишени. Кроме того, фосфорилированию могут подвергаться белки хроматина (гистоны, сигма-фактор, РНК-полимеразы) и рибосомальные белки (например, белок 6S), в связи с чем стимуляторы процессов фосфорилирования могут и непосредственно воздействовать на транскрипцию и трансляцию белков. Однако все эти эффекты оказываются неспецифическими, поскольку ускоряется или замедляется, как правило, общий белковый синтез. Так, инсулин, помимо своей способности регулировать поступление глюкозы в клетку-мишень, может ускорять общий белковый синтез, активируя через определенные внутриклеточные посредники процессы трансляции. Кроме того, инсулин усиливает поступление в клетки-мишени не только глюкозы, но аминокислот, что также косвенно способствует усилению общего белкового синтеза. В то же время в печени инсулин ингибирует синтез ферментов глюконеогенеза. Кроме того, инсулин способен регулировать активность ферментов плазматической мембраны (подавляет активацию аденилатциклазы, вызванную глюкагоном или адреналином), цитоплазмы (ингибирует фосфодиэстеразу), эндоплазматического ретикулума и митохондрий, подавлять протеолиз. Некоторые мембраннотропные гормоны, повышающие уровень цАМФ в клетке, способны влиять не только на каталитическую активность ферментов, но и на проницаемость клеточных мембран для ионов или метаболитов, а также на индукцию-репрессию синтеза белка, поскольку цАМФ в некоторых клетках может регулировать состояние мембран или процессы транскрипции. При этом такие цАМФзависимые эффекты мембраннотропных гормонов на проницаемость мембран или синтез клеточных белков являются вторичными, поскольку реализуются в основном путем цАМФзависимого фосфорилирования белков мембраны или хроматина.

Вместе с тем, для клетки наиболее важна специфическая индукция и репрессия синтеза белка: т.е специфическая индукция и репрессия синтеза белка, сопровождающаяся изменением концентрации лишь одного или нескольких строго определенных белков в клетке-мишени при неизменной концентрации других. Такую регуляцию способны осуществлять гормоны, проникающие внутрь в клетки и, в конечном итоге, в ядро, – стероидные и тиреоидные гормоны. Эти гормоны благодаря своему специфическому действию через клеточный геном контролируют процессы роста, развития и дифференцировки тканей (оказывают морфогенетический эффект). При этом, действуя через определенный регуляторный механизм, стероидные и тиреоидные гормоны могут прямо или опосредованно использовать и другие способы регуляции. В частности, они, наряду с геномным эффектом, способны негеномным путем регулировать состояние биологических мембран, активность ряда ферментов и некоторых специфических белков клетки.

Геномные механизмы действия стероидных гормонов. Мембраны животных клеток не препятствуют проникновению молекул стероидов, в связи с чем эти гормоны могут проник

Дата добавления: 2015-02-06 | Просмотры: 2357 | Нарушение авторских прав