АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ДИАГНОСТИКА. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Основными методами лабораторной диагностики являются, выделение вируса, прямая и непрямая ИФ, РДП, радиоиммунологический метод, кожная проба, РН, РСК, ELISA и биопроба. Для БА нужна крупномасштабная диагностика в виде серологического обследования свинопоголовья хозяйств - поставщиков (племенных и репродуктивных ферм) на уровне области или респуб­лики по аналогии с исследованиями на бруцеллез и туберкулез. Указанные категории хо­зяйств должны иметь характеристику эпизоотологического статуса по данной инфекции. Современные методы позволяют это осуществлять исследуя пробы почек, селезенки, печи ни и лимфоузлов на наличие антигена ВБА с помощью РИД, РСК, ИФ, ИФА.

Вирус БА выделяется в культуре клеток ВНК-21 и ПСГК-30 и идентифицируется в РСК, ИФ и РРИД Предложен метод получения высокоактивной специфической сыворотки дм диагностики БА. Создан полноразмерный ДНК-зонд ВБА, характеризующийся вы­сокой чувствительностью Зонд использовали как при проведении реакции молекулярной. гибридизации, так и для повышения чувствительности рестрикционного анализа. Разработан диагностический тест, позволяющий дифференцировать инфицированных и вакци­нированных gl-вакциной животных. Эта тест-система в совокупности с высокоэффективной; маркированной gl-вакциной может быть использована для разработки программы искоре­нения БА в хозяйствах и регионах. МонАТ можно использовать для обнаружения ВБА в различных материалах. В стаде, в котором взрослые свиньи заражались, ВБА мог длительно циркулировать на свиньях старше 3-4-х мес. Он может быть выделен даже при использова­нии системы пусто-полно.

Экспресс-диагностика. Методика получения высокоочищенной ДНК ВБА для диагно­стики с использованием методов рестрикционного картирования, ПЦР и секвенирования разработана во ВНИИЗЖ. Можно проводить детекцию ВБА при помощи ПЦР и твердофазной гибридизации в плашках для микротитрования по методу детекции простого герпеса ВПГ-1 и ВПГ-2, поскольку разработан вариант ПЦР, позволяющий проводить одно­временную детекцию и генотипирование ВПГ из клинических образцов при использования меченных флюоресцирующих праймеров, способных амплифицировать полимеразные гены ВПГ-1 и ВПГ-2. При сопоставлении разработанного метода со стандартным культуральным методом индикации вируса показана его 100%-ная чувствительность и 94,2%-ная специ­фичность.

Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. Для выделения ВБА используют головной мозг, ку­сочки легких, селезенки, печени, лимфоузлов, миндалин, полученные при вскрытии трупов Миндалины - наилучший материал для выделения вируса. При жизни от больных сви­ней вирус можно выделить из носовых секретов, в которых он появляется на 4-6-й день по­сле болезни и сохраняется в течение 5 -11 дн после выздоровления. Показана возможность выделения ВБА из ганглиев тройничного нерва латентно инфицированных свиней. Oт абортировавших используют плоды и плаценту.

При сборе материалов для вирусологического исследования следует помнить о неравно­мерном распределении вируса в разных участках мозга, поэтому, чтобы избежать ошибок при постановке диагноза, следует брать минимум 2-3 пробы из разных участков мозга, рас­положенных на некотором расстоянии друг от друга. Обычно при вскрытии отбирают ку­сочки мозжечка, продолговатого мозга, больших полушарий головного мозга. В лаборато­рии материалы обрабатывают обычными методами. Для большей вероятности выделении вируса и уменьшения количества исследуемых образцов кусочки из различных отделов моз­га от одного животного объединяют в общую пробу, которую затем измельчают и обрабатывают антибиотиками.

Выделение вируса на лабораторных животных. В качестве лабораторной модели для выделения ВБА обычно используют кроликов массой 2-2,5 кг, которым внутримышечно или подкожно вводят по 1 мл 10%-ной суспензии исследуемого материала. Инкубационный пе­риод в этом случае продолжается 36-48 ч, иногда он может длиться 4-6 дн., а в некоторых случаях - даже до 12 дн. Различают энцефалитическую, менингиальную, паралитическую, зудневую и стертую формы болезни. Течение экспериментальной инфекции во многом зави­сит от способа заражения. Биопробу считают положительной, если кролики погибают с кли­ническими признаками БА (нервная форма, зуд, расчесы) через 2-10 дн после инокуляции суспензии из патологического материала. Если кролики погибают без признаков БА, био­пробу повторяют, используя патологический материал первого пассажа. Считают, что ино­куляция материала в переднюю камеру глаза кролика приводит к характерной зудневой форме болезни. Материалом для выделения вируса от погибших кроликов служат ткани го­ловного и спинного мозга, а также паренхиматозные органы (легкие, печень). Гибель кро­ликов после введения материала от свиней или пушных зверей без признаков зуда и расче­тов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов ВБА.

Выделение вируса в культурах клеток. Показано, что культуры клеток так же чувст­вительны к ВБА, как и кролики, к тому же они могут быть использованы для лабораторной диагностики атипичного течения болезни, при котором опыты по выявлению вируса в мозге свиней путем заражения кроликов дают отрицательные или нетипичные результаты. Обычно используют первичнотрипсинизированные культуры клеток почек и щитовидной железы свиней, семенников телят, фибробластов КЗ, перевиваемые клетки РК-15, ВНК-21. К вирусу высокочувствительны субкультуры первого пассажа клеток почки поросенка и КРС. При первичном выделении вируса признаки ЦПД появляются на 4-5-й день после инокуляции культуры. В последующих пассажах сроки появления ЦПД сокращаются до 15-20 ч, причем оно становится более выраженным. Характер ЦПИ в различных культурах может быть неодинаковым, что обусловлено различным действием вируса на клетки эпителиального и фибробластического типов. В культуре клеток почки поросенка, эмбриона свиньи или крольчонка ЦПД вируса выражается в образовании синцития. Сначала в культуре появляются очаги круглых клеток, границы между которыми исчезают, а ядра перемещаются к центру и образуют конгломераты, окруженные общей оболочкой. Через несколько часов группы этих клеток принимают шарообразную форму, в цитоплазме их появляется зерни­стость. Затем происходит обильное отслаивание клеток с поверхности стекла. В культу­ре фибробластов КЭ цитопатогенное действие вируса проявляется в округлении клеток, по­явлении зернистости и вакуолизации цитоплазмы с последующим отслоением клеток от по­верхности стекла.

Серологическая идентификация. Для идентификации ВБА используют в, основном, РН в культуре клеток или на кроли­ках, ИФ, РДП и др. Кроме того, для этой цели можно использовать РСК, однако из-за нестандартности АГ и непостоянства результатов самой реакции она не нашла широкого применения.

PH. Удобный и надежный метод индентификации выделенного вируса. Используют культуру клеток того же вида, на которой был изолирован вирус. Реакцию ставят по обще­принятой методике, чаще используют вариант: различные разведения вируса (10^-1 – 10^-7) и постоянную дозу сыворотки. Результаты РН учитывают по ЦПД через 2-5 сут. Вирус счита­ют идентифицированным, если индекс нейтрализации составляет 2 и выше.

ИФ. Используют для быстрой индикации и идентификации АГ ВБА в клеточных куль­турах, инфицированных материалом, содержащим вирус, а также в замороженных срезах ткани мозга кроликов, зараженных суспензией патологического материала, или поросят, за­болевших в естественных условиях. Препараты готовят и окрашивают по общепринятой ме­тодике. В положительных случаях в срезах мозга обнаруживают специфическую флюоресценцию. В головном мозге поражаются, главным образом, нейроны коры. При малом уве­личении можно видеть широкие полоски флюоресцирующих нейронов, в которых заметны только отдельные флюоресцирующие клетки. В срезах мозжечка пораженные клетки рас­пределены более беспорядочно. Часто они видны как флюоресцирующие фокусы в зерни­стом слое. Иногда в них оказываются вовлеченными единичные клетки Пуркинье, но особо­го аффинитета вируса к этим клеткам обычно не наблюдают.

Распределение флюоресценции внутри клеток может варьировать в широких пределах. Иногда вирусный АГ обнаруживают как в цитоплазме, так и в ядре, но обычно свечение ядра выражено сильнее. Часто флюоресцирующие массы имеют вид светящейся пыли или мелких гранул. В отдельных случаях удается обнаружить внутриядерные включения типа А Коудри, однако более неправильной формы, чем в препаратах, фиксированных и окрашен­ных обычными методами. Иногда светится только цитоплазма, причем степень свечения и характер распределения также варьируют. Часто обнаруживают скопление светящихся гра­нул вокруг ядер. В некоторых районах можно заметить мелкие светящиеся частицы вдоль аксонов. Для выделения вируса инфекционный материал, полученный из мозговой ткани, миндалин и селезенки животных, наносят непосредственно на монослой чувствительных к вирусу клеток и центрифугируют 40-60 мин при 1500g. Затем инокулят заменяют питатель­ной средой, а инфицированные клетки инкубируют в термостате в течение 12-14 ч. После фиксации препараты обрабатывают конъюгатом монАТ с ФИТЦ и исследуют в люминес­центном микроскопе. Результаты ИФ хорошо согласуются с данными биопробы на кроликах и результатами выделения вируса в культуре клеток.

Предложен метод диагностики БА посредством обнаружения вируса в срезах головного и спинного мозга, миндалин, легких, селезенки и бронхиальных лимфоузлов. Точный диаг­ноз удается поставить в 75-81% случаев. Специфическую ИФ в мазках-отпечатках слизи­стой глотки поросят наблюдают с 1-го по 12-й дн после экспериментального заражения ви­рулентным шт., а в препаратах из мозга на 4-й дн. При отсутствии клиники АГ обнаруживают в мазках из глотки и мозга соответственно на 2-10-й и 2-6-й день.

Вирусный АГ в ИФ выявляют в первичных культурах клеток и КЭ через 18-24 ч после заражения. При исследовании в ИФ отпечатков головного, спинного мозга, легких и селе­зенки больных животных АГ обнаруживают с 3-4-го дн после заражения. С помощью ИФ специфический АГ в культуре клеток тестикул бычка выявляется в оптимальные сроки по­сле заражения (24-40 ч) в титре 5-10 lg ТЦД₅₀/0,2 мл.

РНГА. Антиген ВБА с помощью иммуноглобулинового варианта РНГА и РТНГА мож­но выявлять за 1-3 дн до появления клинических признаков болезни, в период болезни и по­сле переболевания. При приготовлении эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума используют гипериммунную сыворотку свиней и крыс с титром ВНА 11,5 и 11,0 log₂ соответственно. Данные реакции имеют преимущества перед РН.

РДП. Реакцию применяют для идентификации вируса, репродуцированного в культуре клеток. Получены результаты при исследовании полевого мате­риала микрометодом РДП.

РИЭФ. Это ускоренный метод распознования АГ. Антиген ВБА в электрополе движется к аноду, AT - к катоду, и на месте их встречи образуется линия преципитации. Время появленя полос зависит от напряжения тока. РИЭФ значительно чувствительнее и протекает в 15 раз быстрее, чем обычная РДП.

РСК. Данная реакция не нашла широкого применения, так как положительные результаты получаются при использовании специального метода изготовления АГ. Однако РСК рекомендуется как диагностический метод при индикации ВБА в инфицированных культурах клеток и патологическом материале в условиях биопредприятий, производящих вакцину против этой болезни, и для практических ветеринарных лабораторий.

ИФА. Можно быстро идентифицировать вирус прямым ИФА. Антисыворотку к вирусу для мечения ферментом получают на поросятах 6-мес возраста. ИФА по чувствительности равен ИФ и превосходит метод выделения вируса в культуре клеток. При окрашивании прямым иммунопероксидазным методом в мазках-отпечатках обнаруживали клетки, содержащие АГ вируса в виде красно-коричневых гранул в цитоплазме и ядре нейронов мозга и в эпителии слизистой оболочки фаренгиальной области.

Метод рестрикционного анализа и гибридизации. С помощью специфических гибридизационных зондов разработана экспресс-диагностика БА у свиней. Предложен метод точечной гибридизации (ДНК-зонда) для выявления вируса в материалах из органов свиней. Чувствительность зондов р ТМ 11 для выявления ДНК ВБА составляла 20 пг вирусной ДНК. Метод дот-блот гибридизации коррелирует с методами выделения вируса из тканей животных, павших при остром течении болезни. Он позволит выявлять геном вируса при латентной инфекции. Гибридизационные зонды, основанные на применении рекомбинантной ДНК, позволяют обнаруживать вирусный геном в костном мозге (50%), макрофагах, лимфоцитах и тимусе (20%) зараженных поросят.Метод быстрой диагностики с помощью гибридизации с использованием биотинилированных ДНК-зондов на фиксированных формалином парафинированных срезах тканей.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При диагностике ВБА к серологическим данным необходимо относиться осторожно, поскольку не исключено, что часть положительных результатов может быть обусловлена другими ГВ КРС или другими штаммами ВБА с низкой вирулентностью. Диагноз на прошедшую инфекцию ставят обычно при помощи РН в культуре клеток, определяя титры ВНА к ВБА в сыворотках крови реконвалесцентов. Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом в 3-4 нед. Титры AT у переболевших животных могут колебаться в широких пределах - от 1-32 до 1:256. У поросят и подсвинков, зараженных ВБА, специфические ВНА появляются к 6-8-му дню после заражения, достигая максимума через 3-4 нед. Через 100 дн. после заражения титры ВНА начинают снижаться, а через 135 дн. AT уже обычно не находят. У естественно больных и переболевших подсвинков ВНА удается установить примерно в те же сроки, хотя в сыворотках переболевших свиней их иногда удается обнаружить в течение 4,5 лет. AT также находят и у свиней, перенесших бессимптомную инфекцию. Динамика ВНА у животных других видов недостаточно изучена. Характерным является увеличение титра AT у свиноматок непосредственно перед опоросом: новорожденные поросята получают AT от матерей. Для обнаружения и титрования AT, кроме РН, применяют РНГА, РДП, РСК, ELISA.

РН. ставят с постоянной дозой вируса (1000 ТЦД₅₀/0,1мл) и разными разведениями сыворотки (от 1:2 до 1:16) по общепринятой методике. Для выявления животных, инфицированных ВБА в естественных условиях, РН более надежна, чем вирусологическое исследование смывов полости рта и глотки. Наибольшей чувствительностью обладает метод постановки РН в культуре клеток Vero.

РНГА. Сообщалось об успешном применении РНГА для выявления специфических антител в молозиве, молоке и сыворотках крови животных. Пробы молока и молозива берут течение недели после опороса свиноматок и консервируют их 1% р-ром борной кислоты. Сыворотку молока и молозива перед реакцией инактивируют при 56°С 30 мин. Для изготовления эритроцитарного диагностикума наиболее пригоден концентрированный культуральный вирус с титром 8,5 ТЦД₅₀/мл. Некоторые авторы считают, что РН менее чувствительная, чем РНГА, с помощью РН AT на ранней стадии болезни не выявлялись, их обнаруживали лишь с 12-го дн, тогда как РНГА - на 5-й дн.

ВИЭФ. Рекомендуют для выявления AT к данному вирусу. АГ для ВИЭФ готовят, выращивая вирус на первичной культуре клеток почек свиней Результаты ВИЭФ полностью коррелировали с данными РН. Для проведения ВИЭФ были пригодны как нативные, так и инактивированные АГ ВБА в 1%-ной агарозе при напряжении 10 В/см в течение 60 минут. В сыворотках всех больных животных с 7-10-го дня выявляли AT.

РДП. Для ориентировочных диагностических исследований РДП оказалась вполне пригодной в программе борьбы с БА. Для получения АГ после концентрации и очистки вируса применяют химические детергенты (20%-ный дезоксихалат натрия, 20%-ный тритон X, 1%-ный β-меркаптоэтанол) и добиваются АГ фракции такой чувствительности, которая в РДП с сывороткой титра 1:4 дает в 100 и 85-90% случаев четкую положительную реакцию. Есть метод концентрирования вируса БА с помощью ПЭГ.

ELISA. Он в 60-100 раз более чувствителен, чем PH. AT в ELISA обнаруживают на 5-6й дн после заражения, в РН - на 9-10-й. Иммуноглобулины классов IgG и IgM определяют в ELISA с 5-го дня после инокуляции вируса, причем максимум титров IgM приходился на 9-10-е сут, а IgG - на 10-15 сут. ELISA вполне может быть использован вместо РН для диагностики болезни при условии наличия соответствующего оборудования и высококачественных диагностических наборов.

Латексагглютинация. Для ускоренной серологической диагностики предложен метод агглютинации частиц латекса, покрытых антигеном ВБА. Наличие в исследуемой сыворотке специфических AT вызывает агглютинацию частиц, регистрируемую визуально. Реакция с латексом отличается высокой чувствительностью. Ее применение особенно эффективно в ранних фазах инфекции, когда в сыворотке больных животных содержится значительное количество IgM с высокой агглютинирующей активностью.

РИА. Для определения специфичных сывороточных AT превосходит по чувствительно­сти РН и широко применяется в виде непрямого твердофазного микрорадиоиммунологического теста Обладая высокой чувствительностью, он не зависит от культуры клеток и явля­ется быстрым, точным и пригодным для массовых анализов. С использованием монАТ раз­работаны модифицированные реакции радиальной иммунодиффузии ферментного и микро-иммуноферментного определения AT к данному вирусу. Оба вируса пригодны для проведе­ния сероэпизоотологического обследования на БА в полевых условиях. Предложен новый метод определения AT к ВБА в сыворотках свиней с помощью непрямого иммунопероксидазного окрашивания бляшек. По чувствительности, специфичности он превышает ИФА.

Аллергическая проба. Разработан кожный аллергический метод диагностики БА. Он позволяет в короткий срок ставить диагноз непосредственно в хозяйствах. Метод основан на феномене гиперчувствительности замедленного типа у латентно больных животных. При введении убитого нагреванием АГ в нижнее веко, внутреннюю и дорсолатеральную часть грудной клетки, а у поросят в медиальную поверхность бедра, реакция наблюдается через 24-48 ч и выражается образованием отечной припухлости тестоватой консистенции от 2 до 4 см в диаметре с покраснением в центре (место введения АГ). Чувствительность реакции достаточно высокая 72% переболевших животных реагируют положительно. Из числа пе­реболевших без клинических признаков реагируют положительно 47% животных. Реакция проявляется в более поздней стадии болезни, которая сохраняется после прекращения эпи­зоотии. Ее можно использовать для выявления стационарных очагов инфекции. Высокий титр ВНА и процент положительных кожноаллергических реакций обнаруживали у перебо­левших животных через 14 и 30 да после заражения. Аллергическая проба выяв­ляет инфицированных животных с 7-го по 20-й день болезни.

Дифференциальная диагностика. БА следует дифференцировать у свиней от болезни Тешена, чумы, бешенства, гриппа, сальмонеллеза, отечной болезни, листериоза, дипло, стрептококкоза, гипогликемии, солево­го отравления, аскаридоза, авитаминоза; у крупного и мелкого рогатого скота - от бешенст­ва, листериоза, кормового отравления, ценуроза; у лошадей - от менингоэнцефалита, бешен­ства, отравления; у пушных зверей - от чумы и энцефаломиелита лисиц, у собак - от бешен­ства, чумы, у кошек - от бешенства.

Для дифференциации от бешенства проводят биопробу на мышатах и ИФ, а также мик­роскопию для выявления телец Бабеша – Негри. Для исключения чумы, болезни Тешена ставят биопробу на кроликах, гриппа свиней - проводят биопробу и исследуют выделенный вирус в РГА, РТГА Листериоз, сальмонеллез, отечную болезнь и другие бактериальные ин­фекции исключают бактериологическим исследованием, отравления - по данным лабораторного химического анализа и биопробы.Существует схема дифференциальной диагности­ки БА с использованием культуры клеток.

Дата добавления: 2014-12-11 | Просмотры: 858 | Нарушение авторских прав